微生物學檢驗實驗指導-全文預覽

　　

【正文】 ，先將焦性沒食子酸放入平皿蓋背面的滅菌紗布中，再滴入NaOH，立即將接種細菌的平板扣上，用熔化的石蠟密封平皿和平皿蓋的縫隙，置35℃溫箱培養。C6H8O7+3NaHCO3→Na3(C6H5O7)+3H2O+3CO2↑NaBH4+2H2O→NaBO2+4H2↑（2）厭氧袋法：厭氧袋是用無毒透明、不透氣的復合塑料薄膜制成。（750mmHg），再充入無氧氮氣，反復三次，最后充入80%N10%H2和10%CO2混合氣體，若缸內呈無氧狀態，則指示劑美藍為無色。該法適用于空腸彎曲菌、幽門螺桿菌等微需氧菌的分離培養。隨著缸內蠟燭燃燒產生的CO2增加，蠟燭逐漸自行熄滅，此時缸內的CO2濃度約為5~10%，置35℃培養箱孵育18~24h后觀察結果。大多數細菌生長速度快，在孵育18~24h后即可見到生長現象，但若標本中的菌量少或生長速度慢的細菌（如結核分支桿菌），則需培養3~7天甚至4~8周后才能觀察到生長現象。廢棄的有菌材料（如玻片、有菌的平板、試管、吸管等）均需滅菌后再清洗。（5）平板劃線時注意掌握好劃線的力度和角度，用力不能過重，接種環和培養基表面大約呈30~40176。操作時不宜說話或將口鼻靠近培養基表面，以免呼吸道排出的細菌污染培養基。6．傾注培養法此法常用于標本或樣品中活菌計數。（1）活菌計數：，用無菌L型玻璃棒將液滴涂布均勻，蓋上平板蓋，經35℃培養18~24h后計數菌落，則每毫升所含活菌數=菌落數10稀釋倍數。（2）左手拿試管，打開試管塞后，試管口通過火焰滅菌，再將取有細菌的接種環由斜面底部向上劃一直線，再由下至上在斜面上作曲線劃線。3）劃線完畢，將平板扣入平板蓋，接種環燒灼滅菌后放回原處。4）在平板底上做好標記，經35℃培養18~24h后觀察結果。2）左手斜持平板，用手掌托著平板底部，五指固定平板邊緣，在酒精燈旁以拇指、食指和中指將平板蓋撐開大約30~45176。（2）左手拿試管，右手持接種針，將試管塞打開后，試管口通過火焰滅菌，將接種針從培養基的中心向下垂直穿刺接種至試管底上方約5mm處（勿穿至管底），然后由原穿刺線退出，（3）將試管口滅菌后加塞，接種針燒灼滅菌后放回原處。（4）將試管口滅菌后加塞，接種環燒灼滅菌后放回原處。二、細菌的接種方法1．液體培養基的接種 該法主要用于細菌的增菌培養或進行細菌的生化反應。 接種環用于固體、液體培養基的接種，接種針用于半固體培養基的接種。其中環（針）部分最佳材料為白金絲，因其受熱和散熱速度快，硬度適宜，不易生銹且經久耐用，但因為價格昂貴而限制了其應用。【試劑與器材】1．菌種：葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌等。（4）在加熱溶化時注意溶液不能溢出瓶外，否則會影響培養基的營養成分，若水分蒸發，應補足失去的水分。裝培養基的容器不能用鐵、銅等材質的容器，若鐵進入培養基中，；。（7）鑒定 包括兩項內容：1）無菌試驗：將滅菌后的培養基置35℃溫箱孵育24h，無菌生長為合格。2）間歇滅菌法：用于含糖、明膠、血清、牛乳、雞蛋等不耐高溫物質配制的培養基滅菌。3）半固體培養基：分裝于試管，量約為試管高度的1/4~1/3，滅菌后趁熱將試管直立凝固。（5）分裝　根據需要將培養基分裝于不同的容器中，并進行包扎。計算：，現配制1000ml培養基，需加入NaOH的量為：5∶1000=∶X，則X=（1000）/5=30ml為防止培養基因矯正PH而加入過多的水，則需3ml。比色法：取3支與標準管口徑相同的試管，按下表加樣。（1）調配：先在錐形瓶或燒杯中加入少量蒸餾水（事先量好），按照培養基的配方準確稱取各種成分加入瓶中混合，再將剩余的水沖洗瓶壁。按照物理性狀分為：液體、半固體和固體培養基三類，其區別主要是凝固劑的有無和多少；按用途分為：基礎、營養、選擇、鑒別、增菌、特殊培養基等。如用干烤法應注意控制溫度和時間在160~170℃2h，以免燒焦棉塞及外包的紙張等。若是盛有液體培養基的試管，應直立并扎成捆，以免滅菌時傾倒。在消毒或滅菌之前，均應先將清水抽入針頭及注射器內反復抽洗幾次，并連同洗出水一起消毒或滅菌，以免加熱時有蛋白質凝固而阻塞針頭或注射器。 2）試管：作血清反應的試管若不含病原微生物，可先用5％熱肥皂水刷洗，再用自來水沖洗；若不夠清潔，可先用清潔液（配制法見附錄二）浸泡數小時，然后用自來水沖洗7次以上，晾干備用。【實驗內容】一、常用玻璃器材的洗滌和準備1．玻璃器材的洗滌 玻璃器材若不清潔，常可影響實驗結果，如影響培養基的pH值，甚至由于某些化學物質的存在可抑制微生物的生長；試管不清潔也可影響血清學反應的結果，如在pH3時可發生酸凝集。2．熟悉培養基的種類、主要成分及用途。圖21 懸滴法 3．暗視野顯微鏡觀察將上述經壓滴法制成的標本片，置于暗視野顯微鏡下觀察，有鞭毛的細菌運動活潑，在黑色的背景下閃閃發亮，有明顯的位置移動。用小鑷子挾一蓋玻片，先使蓋玻片一邊接觸菌液，然后緩緩放下，覆蓋于菌液上，避免菌液中產生氣泡。結果：菌體染成藍綠色，異染顆粒染成藍黑色。3），水洗。3）用硫酸銅溶液將玻片上的染液洗去（注：切勿水洗），用吸水紙吸干后鏡檢。3）復染：用堿性美藍染1min，水洗，待干、鏡檢。3．芽胞染色法（1）涂片、干燥、固定：同革蘭染色法。（4）滴加染液（配方見附錄二），染色約10~15min后，將玻片微傾斜，用蒸餾水緩慢滴加在玻片頂端無菌膜處洗去染液，注意洗凈染液表面的金屬光澤液膜。（1）玻片的處理：要求用新的載玻片，用前在95%乙醇中浸泡24h以上，用時從酒精中取出，用干凈的紗布擦干使用。（3）滴加5g/L龍膽紫染色3~5min，水洗，待干、鏡檢。5．醫學意義：通過革蘭染色有助于細菌的初步鑒別，并可作為選擇藥物的參考，了解細菌的致病性。（2）脫色時間長短要適宜，如果涂片較厚應相應的延長脫色時間，如涂片較薄則相應的縮短脫色時間，脫色時應不斷旋轉玻片搖勻，使其充分脫色，通常脫到乙醇中沒有紫色流下即可。固定的目的在于殺死細菌，并使菌膜與玻片牢固粘附，避免染色過程中被水沖洗掉，通過固定還可凝固細胞質，改變細菌對染料的通透性，使細菌易與染料結合而著色。2．方法 （1）涂片：取清潔無油跡的載玻片1張，用蠟筆劃線將其分成左右兩格。二、革蘭染色1．染色原理（1）等電點學說：革蘭陽性菌的等電點（pI2～3）比革蘭陰性菌（pI4～5）低，在同一pH條件下革蘭陽性菌帶負電荷比革蘭陰性菌要多，與帶正電荷的堿性染料（結晶紫）結合性牢固，不易脫色。3．其他：載玻片、接種環、酒精燈、顯微鏡、香柏油、蠟筆、擦鏡紙、脫油劑等。3．熟悉不染色標本檢查法（壓滴法和懸滴法）的方法與結果觀察。3．注意事項（1）熒光顯微鏡如用高壓汞燈作光源，使用時一經開啟不宜中斷，斷電后需待汞燈冷卻后（約15min）方能再啟用。（2）濾光片：1）激發濾光片裝于光源與聚光器之問，可選擇性使紫外光及紫蘭光通過，激發熒光素發出熒光；2）吸收濾光片裝于物鏡與目鏡之間，可吸收紫外光及紫蘭光，僅讓熒光通過，以便觀察標本和保護眼睛。2．使用方法：（1）將顯微鏡聚光器御下，裝上暗視野聚光器，置暗室，使用人工光源。此聚光器中央為一黑板所遮，光線不能直接通向鏡筒，使視野背景黑暗。（6）鏡頭必須保持清潔，油鏡使用完后應立即用擦鏡紙拭去香柏油。（3）避免強酸、強堿、氯仿、乙醚、酒精等化學藥品與顯微鏡接觸，避免日光直射，顯微鏡須經常保持清潔，勿使油污和灰塵附著。觀察時應將兩只眼睛同時睜開，左眼觀察，右眼用于繪圖或記錄。（2）低倍鏡調焦：將欲觀察的標本置載物臺上，用彈簧夾和推進器固定，將待檢部位移至視野正中央，上升載物臺至不能升高為止。 3．使用方法（1）采光：使用顯微鏡時必須端坐，將顯微鏡放在胸前適當位置。（2）高倍鏡：鏡頭標志為40或40/，鏡頭較長，其上常刻有藍色環圈。【實驗內容】一、細菌基本形態和特殊構造的觀察1．細菌的基本形態（各種球菌、桿菌、弧菌等）觀察要點：注意細菌的染色性、相對大小、形狀及排列方式。2．掌握細菌基本形態和特殊結構的觀察方法。實驗室管理者應對實驗室的風險級別進行分析，尤其對風險級別較高的、接觸高危標本幾率較大的區域如微生物和分子生物學室予以高度重視，保護實驗室工作人員和環境的安全。建立健全了各項生物安全制度，還應成立生物安全管理領導小組，加強生物安全制度實施情況的監督管理，實驗室入口處須粘貼生物安全標志，注明危險因素，生物安全級別，負責人姓名和電話，進入實驗室的特殊要求及離開程序，禁止非工作人員進入實驗室，如需參觀實驗室等特殊行為需經實驗室負責人的批準后方可進入。（9）有可靠的電力供應和應急照明。（6）實驗室內應保證工作照明，避免反光和強光。（2）每個實驗室均應設置洗手池，宜設置在靠近出口處。四級生物安全防護實驗室（BSL4）適用于對人體具有高度的危險性，通過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，目前尚無有效的疫苗或治療方法的致病微生物及其毒素。2．生物安全實驗室分級與要求由于各種病原微生物的危險度等級不同，因此實驗室必須達到相應的生物防護等級才能開展有關實驗。三、生物安全防護知識簡介醫學檢驗工作人員長期接觸有潛在傳染性的血液、糞便、體液等標本，這些標本往往是各種細菌、病毒等病原微生物的傳播載體，無論是實驗人員感染，還是造成實驗室和周圍環境的污染，都將導致嚴重的后果。（2）化學藥品腐蝕傷：若為強酸，用大量清水沖洗后再以5%碳酸氫鈉溶液中和；若為強堿，用大量清水沖洗后再以5%醋酸或5%硼酸溶液中和；若受傷處是眼部，經上述方法處理后，再滴入橄欖油或液體石蠟1~2滴。需送溫箱培養的物品，應標記清楚后送到指定地點。不準在實驗室內吸煙、飲水和進食，盡量避免用手觸摸頭、面部，防止感染，盡量減少室內活動，以免引起風動。（1）試驗前須預習實驗內容，了解實驗目的、方法和注意事項，做到心中有數，避免發生錯誤，提高實驗效率。3．通過實驗進一步掌握臨床常見病原微生物的生物學性狀、分離培養和鑒定的方法、各種臨床標本的微生物學檢驗程序和方法。2．在微生物學實驗過程中建立無菌觀念，掌握無菌操作技術。因此，實驗中應嚴格遵守實驗規則，建立無菌觀念，嚴格無菌操作，防止實驗過程中出現意外情況，并確保實驗結果的準確。（4）實驗室內不準大聲喧嘩、嬉戲，應保持實驗室的安靜、整潔和有序。禁止將本實驗室的物品帶出實驗室外。2．實驗室意外的緊急處理方法（1）發生皮膚破損或刺傷：首先用肥皂和水沖洗傷口，盡量擠出損傷處的血液，并用70%乙醇或其他皮膚消毒劑進行消毒，立即進行醫療處理。（5）菌液污染環境：將適量2~3%%新潔爾滅浸泡污染面半小時后除去，如手上有菌污染，也可浸泡于上述消毒液中3~5min，之后用肥皂和清水洗凈。基于以上劃分標準，結合微生物的致病性、傳播方式、目前所具有的預防和治療措施等因素，我國衛生部于2006年制定了《人間傳染的病原微生物名錄》，對各種病原微生物的危害程度及其相關實驗活動需要達到的生物安全實驗室級別做了詳細分類，各實驗室進行有關實驗均需參照此標準。三級生物安全防護實驗室（BSL3）適用于有明顯危害、可以通過空氣傳播的病原微生物（如結核桿菌、伯氏立克次體等），通常已有預防傳染的疫苗，該級別實驗室除了有嚴格的一級和二級安全設施要求外，還需具備合適的空氣凈化系統。根據《實驗室生物安全認可準則》，二級生物安全實驗室結構設施需符合以下幾點：（1）實驗室需具有防止節肢動物和嚙齒動物進入的設計，有可開啟的窗戶，有紗窗，實驗室門有可視窗帶鎖并能自動關閉。（5）實驗臺面應能防水、耐腐蝕、耐熱。（8）有適當的消毒設施，如高壓蒸汽滅菌器，并設置洗眼裝置、應急噴淋裝置、急救藥箱、滅火器等。3．實驗室生物安全管理制度實驗室生物安全制度建設對于臨床實驗室而言是生物安全防護的核心，實驗室生物安全管理制度應包括：實驗室準入制度、生物安全培訓制度、生物安全責任制和責任追究制度、生物防護與安全制度、安全檢查制度、個人防護制度、實驗室管理制度、清潔消毒制度、安全計劃審核制度、廢棄物處理制度、事故報告制度、生物安全防護應急預案、標準操作程序等。因此，實驗室人員必須提高生物安全意識，認真學習生物安全相關的各種法規和文件，定期進行生物安全防護知識培訓，熟悉生物防護有關知識，加強基本技能的培養，嚴格執行操作規程。第一章 微生物學檢驗基本技術實驗一 細菌的形態結構觀察及顯微鏡油鏡的使用【目的和要求】1．熟悉微生物實驗室規則并自覺遵守。2．器材及其他：光學顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、香柏油、脫油劑等。圖11 光學顯微鏡的構造顯微鏡的接物鏡有低倍鏡、高倍鏡、油鏡三種，放大倍數依次增高，其識別方法為：（1）低倍鏡：鏡頭標志為10或10/，鏡頭最短，其上常刻有黃色環圈。在油鏡和載玻片之間滴加和玻璃折光率相近的香柏油（n=），則使進入油鏡的光線增多，視野光亮度增強，物象清晰（見圖12）。當用低倍鏡或高倍鏡觀察時，應適當縮小光圈，下降聚光器；當用油鏡觀察時，光線宜強，應把光圈完全打開，并將聚光器上升到最高位置。鏡檢時應將標本按一定方向呈“弓”形移動，直至整個標本觀察完畢，以防漏檢。（2）顯微鏡放到實驗臺上時，先放鏡座的一端，再將鏡座全部放穩，切不可使鏡座全面同時與臺面接觸，這樣震動過大，透鏡和微調節器的裝置易損壞。（5）細調節器是顯微鏡最精細而脆弱的部分，不要向一個方向連續轉動數周，應輕微地來回旋轉。三、暗視野顯微鏡1．構造與原理：在顯微鏡上安裝一個特制的聚光器一暗視野聚光器。正如我們在暗室內，能看到從隙縫漏入的陽光內，有無數顆塵埃微粒跳躍飛舞一樣。四、熒光顯微鏡1．構造：（1）熒光顯微鏡光源：能發射豐富的紫外線光和紫蘭光，常用150~200瓦高壓汞燈。操作同光學顯微鏡。2．掌握革蘭染色的方法、原理、結果觀察及意義。2．試劑：革蘭染色液、細胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理鹽水等。大部分細菌染色的基本程序