第二章基因工程制藥(完整版)

　　

【正文】 表達載體必須具備下列條件： ① 載體能獨立復制 ② 具有多克隆 （ MCS） 位點和標記基因 ③ 具有很強的啟動子 ④ 具有調節(jié)基因 ⑤ 具有很強的終止子 ⑥ 具有產(chǎn)生帶有 SD序列和 AUG的 mRNA的能力 二、大腸桿菌中的基因表達 基因工程藥物研究中常用的表達載體 （ 1） PBV220系統(tǒng) ① PL、 PR串聯(lián)啟動子 ， 增強啟動信號 。 ④翻譯產(chǎn)物的 N末端常多余一個甲硫氨酸殘基（ AUG啟始密碼子 編碼）容易引起免疫反應。 Vitamin A 第二節(jié) 目的基因的獲得 一、 反轉錄法 二、化學合成法 一、反轉錄法 1． mRNA的純化 （ 1）選擇表達目的蛋白質豐度高的 mRNA的生物材料。 一、基因工程技術生產(chǎn)藥品的優(yōu)點 1. 大量生產(chǎn)過去通過常規(guī)生化分離提取技術難以獲得 （ 富集 ） 的 生理活性蛋白和多肽 。 6. 降低成本，提高產(chǎn)品質量。 缺點：①胞內表達，提取困難。 （ 3） 鏈霉菌 優(yōu)點： ① 不致病 ② 分泌能力強 ③ 具有糖基化能力 缺點：培養(yǎng)條件要求高 、 遺傳穩(wěn)定性差 一、宿主菌的選擇 2． 真核細胞 （ 1） 酵母：無毒 、 倍增時間短 、 分泌功能 、 糖基化作用 、 使之 成為理想的宿主 。 ③ 在外源基因的 N末端可融合 6個 His， 便于純化 。 主要與兩個因素有關： （ 1） 含質粒菌產(chǎn)生不含質粒子代的頻率 ， 質粒丟失率與 宿主菌 、 質粒特性和培養(yǎng)條件有關 。 一、建立分離純化工藝需了解的各種因素 2. 物料中雜質種類和性質 物料中雜質種類和性質包括相關性和非相關性雜質的含量、 化學性質、結構、相對分子質量、電荷性質及數(shù)量、生物學特性、 穩(wěn)定性 (對熱、 pH、鹽、有機溶劑等 )、溶解度、分配系數(shù)、揮發(fā)性 及吸附性能等。 五、重組蛋白質的分離純化 1. 離子交換層析： 是以離子交換劑為固定相 ， 依據(jù)流動相中的組分離子與交換 劑上的平衡離子進行可逆交換時 的結合力大小的差別而進行分離 的一種層析方法 。 （ 3） 利用 親和層析 吸附蛋白質 ， 而 DNA不被吸附 ， 也可分離 。 （ 2）要盡可能減少組成工藝的步驟。 2. 重組蛋白在大腸桿菌中表達時，缺乏一些蛋白折疊過程中需要的酶和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，也導致包含體的形成。 ②正確復性的產(chǎn)物易于與錯誤折疊蛋白質分離。 一、醫(yī)藥生物技術產(chǎn)品質量保證的一般性要點 3. 嚴格控制條件 宿主細胞中表達的天然基因，轉錄或翻譯后，或精制、工藝放大過 程中，都有可能發(fā)生變化，故從原料到制成品制備全過程的每一步都 須嚴格控制條件與鑒定質量，確保符合標準規(guī)格、安全有效。 建原始種子批須確證克隆基因 DNA序列，詳細敘述種子批來源、 方式、保存及預計使用期，保存與復蘇時宿主載體表達系統(tǒng)的穩(wěn)定性。 純化工藝過程中應盡量不加入對人體有害的物質 。 效價測定必須采用國際上通用的方法，測定結果必須用國際或國家標 準品進行校正，以國際單位表示或折算成國際標準單位。 （ 2）特異性鑒別 利用免疫印跡、免疫電泳、免疫擴散等免疫學方法，確定蛋白 質的抗原性。 同種產(chǎn)品不同批次的肽圖的一致性是工藝穩(wěn)定性的驗證指標。 （ 8）蛋白質二硫鍵分析 測定巰基的方法有別 PMCB法、 DTNB法、 NEMI法等。 測定采用免疫分析的方法。 五、目的產(chǎn)品的質量控制 藥品的穩(wěn)定性是評價藥品有效性和安全性的重要指標之一，也是 確定藥品貯藏條件和使用期限的主要依據(jù)。 六、產(chǎn)品的保存 1. 液態(tài)保存 液態(tài)保存主要有 4種常用方法： （ 1）低溫保存 蛋白質對熱敏感，溫度越高，穩(wěn)定性越差，在絕大多數(shù) 情況下可以低溫保存蛋白質溶液，液態(tài)蛋白質樣品在 20~ 10℃ 以下冰凍保存比較理想。 六、產(chǎn)品的保存 七、基因工程制藥實例 1. 干擾素 2. GMCSF 3. 人白細胞介素 2 。 六、產(chǎn)品的保存 （ 3）高濃度保存 一般蛋白質在高濃度溶液中比較穩(wěn)定，保存時濃度不能 太 低，否則可能會引起亞基解離和表面變性。 采用恰當?shù)奈锢砘瘜W、生物化學和免疫化學技術對其活性成分的性 質進行全面鑒定，并且要準確檢測在貯藏過程中由于脫氨、氧化、磺 酰化、聚合或降解等造成的分子變化，可選用電泳和高分辨率的 HPLC ，以及肽圖分析等方法。 除宿主細胞蛋白外，目的蛋白本身也可能發(fā)生某些變化，形成在 理化性質上與原蛋白質極為相似的蛋白雜質，在體內往往會導致抗體 的產(chǎn)生，在質量控制中也要加以嚴格控制。 蛋白質含量可根據(jù)其物化性質采用 Folin酚試劑法、染色 法（ Bradford）、雙縮脲法、紫外吸收法， HPLC法和凱氏定 氮法等方法，其中 Folin酚試劑法、染色法是在質量檢定中常 使用的方法。 五、目的產(chǎn)品的質量控制 （ 6）氨基酸組成分析 一般對含 50個左右的氨基酸殘基的蛋白質的定量分析接近 理論值。 （ 4）等電點測定 樣品用等點聚焦法測定等電點。 體內生物活性的測定要根據(jù)目的產(chǎn)物的生物學特性建立適合的生物學 模型。 上樣前應清洗除去熱原質等 。 三、培養(yǎng)過程的質量控制 培養(yǎng)過程中，應測定被表達基因分子的完整性及宿主細胞 長期培養(yǎng)后的基因型特征； 依宿主細胞 /載體穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時間， 并定期評價細胞系統(tǒng)和產(chǎn)品。 根據(jù)指控要求，需明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過；對于改造 過的基因應說明被修改的密碼子、被切除的肽段及拼接的方法； 使用 PCR技術擴增得到的基因，應說明擴增的模板、引物及酶反應 條件等情況，并以