分子生物學研究方法(上)(完整版)

　　

【正文】 2年 Arber 發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，1967年 Gellert發(fā)現(xiàn)了 DNA 連接酶。 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨 DNA片段的范圍為 50kb之間216。在分子生物學研究中，得到應(yīng)用的是放射性同位素。 核酸分子的放射性同位素標記應(yīng)用舉例 利用切口平移技術(shù)制備 DNA放射性探針 分子雜交類型 根據(jù)鑒定對象不同，可將分子雜交法分為 3種類型：Southern雜交由 1975年創(chuàng)立。核酸探針： 指序列或功能特性已知的標記分子，為雙鏈或單鏈，長度通常為幾十至幾百 bp,包括 DNA探針、 RNA探針和 cDNA探針。雜交膜： 尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜等。（ 4）組織原位雜交 （ Tissue in situ hybridization）： 指組織或細胞的原位雜交。① 模板 DNA的變性：模板 DNA經(jīng)加熱至 94℃ 左右一定時間后，使模板 DNA雙鏈解離，使之成為單鏈，以便與引物結(jié)合。避免 5個以上相同堿基的成串排列。例題 2: 如何利用網(wǎng)絡(luò)技術(shù)和 DNA分析軟件設(shè)計簡并引物 , 以 PCR擴增某蛋白的 cDNA?演示 : (1)登錄 NCBI等網(wǎng)站 ,收集有關(guān) cDNA序列信息 。dsDNA變性 → 與 1條標記引物退火 → 在 4個反應(yīng)管中分別加入dNTP和 1種雙脫氧核苷酸 →DNA 聚合反應(yīng) → 反應(yīng)產(chǎn)物變性電泳→ 凝膠干燥 → 放射自顯影 → 序列讀取。 DNA序列測定的自動化 使用自動測序儀 ,使得模板制備自動化、定序反應(yīng)自動化、凝膠電泳自動化、核苷酸序列閱讀與計算機輸入自動化。 DNA序列測定的自動化216。? YAC和 BAC文庫216。 與 cDNA克隆或文庫構(gòu)建有關(guān)的幾個問題 l cDNA的概念： 第一鏈 cDNA； cDNA基因； cDNA編碼序列。包括形態(tài)標記、細胞學標記、生化標記和分子標記等。 現(xiàn)有的現(xiàn)有的 DNA分子標記技術(shù)大體上可分為分子標記技術(shù)大體上可分為 2類類 ，一類是以分子雜交為基礎(chǔ)一類是以分子雜交為基礎(chǔ) 的分子標記，其代表性的分子標記，其代表性技術(shù)是技術(shù)是 RFLP；； 另一類是以另一類是以 PCR為基礎(chǔ)為基礎(chǔ) 的分子標記，的分子標記，如如 RAPD、 SCAR、 SSR、 SSLP、 ISSR、 AFLP、 STS、EST、 SSCP和和 SNP等。為限制片段長度多態(tài)性。 (3) RAPD(Random amplified polymorphic DNA) 隨機擴增多態(tài)性隨機擴增多態(tài)性 DNA 是 一種 建立在 PCR基礎(chǔ)之上的可對整個未知序列的基因組進行多態(tài)性分析的分子標記方法。 AFLP結(jié)合了 RFLP和 PCR技術(shù)特點，具有 RFLP技術(shù)的可靠性和 PCR技術(shù)的高效性。衛(wèi)星基序本身。呈現(xiàn)單鏈構(gòu)象多態(tài)性。被稱為，也可由堿基的插入或缺失所致。 %的一致性，的一致性， ％的差異％的差異 從志愿者身上取得了 DNA樣本，這些志愿者分別是歐洲、非洲和中國人的后裔。 2 基因克隆技術(shù)簡介5ˊ GACTCGAGTCGACATCGA(T)17 3ˊ Xho I Sal I Cla I Oligo(dT) adaptor primerAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC3’TTTTTTTTTTTAGCTACAGCTGAGCTCAG5’reverse transcriptionPCRAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC3’TTTTTTTTTTAGCTACAGCTGAGCTCAG5’GSPadaptor primerAAAAAAAAAA3’TTTTTTTTTTTAGCTACAGCTGAGCTCAG5’mRNARE siteRE siteRE sitedigest with restriction enzymes and clone3ˊ RACEGSP1AAAAAAAAAA3’1. reverse transcription3. Anneal primersand do PCRmRNARE site RE sitedigest with restriction enzymes and clone5ˊ capremove RNA and GSP1CCCCC2. terminal transferase+ dCTP3’CCCCC5’GACTCGAGTCGACATCGA(G)173’ Xho I Sal I Cla I5’GACTCGAGTCGACATCGAGGGGG3’GSP2 CCCCC5’GACTCGAGTCGACATCGAGGGGGadaptor primer5ˊ RACE 圖位克隆法（ mapbased cloning）與染色體步移（ genomic DNA Walking）(1) 圖位克隆法（ mapbased clonig） ,定位克隆（positional cloning） 首先，將目的基因定位到某個染色體的特定位點，并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的 RFLP或 RAPD分子標記。RELP克隆 目的基因起始克隆E HB B HB H H E32P(a)(b)(c)(d)(e)32P(f)目的基因克隆多次重復(fù) (a) ~ (c)步驟，逐步逼近目的基因(2) 染色體步移 (chromosome walking) 是根據(jù)已知的 DNA序列得到其側(cè)翼序列的技術(shù)。再用新得的插入片段的末端部分作為探針，去進一步篩查文庫。最后 ,根據(jù)基因功能互作原理鑒定目的基因。可分為 3ˊRACE 和 5ˊRACE 兩種 。216。可用于檢測點突變。標記中引物設(shè)計困難的缺點。 微衛(wèi)星在結(jié)構(gòu)上的最大特點是其兩端序列較保守。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測多態(tài)性。標記。 每種分子標記技術(shù)都有其優(yōu)缺點，可根據(jù)實每種分子標記技術(shù)都有其優(yōu)缺點，可根據(jù)實驗材料和研究目的的不同靈活選用。 分子標記 : 分子標記指能反映生物個體或種群之間基因組 DNA差異的 DNA序列 。l mRNA的純化 ： 0ligo（ dT） 纖維素柱層析；抗生物素蛋白 磁珠吸附法 。 基因組文庫 : 含有某種生物全部遺傳信息的重組 DNA分子的克隆總體。 克隆（ clone）： 作名詞用，是指具有相同 DNA分子的一個群體或基因型相同的一個生物群體。另一方面則是指 “ 讀片過程 ” 的自動化。 雙脫氧核苷酸鏈終止法測序 (Sanger法 )原理DNA sequencing gel showing the separation of fragments in the four sequencing reactions (one per lane). 216。216。⑤ 引物 3ˊ 末端堿基，應(yīng)與模板單鏈 嚴格 配對。3’3’5’Primer 1Primer 25’3’5’5’3’5’ 3’3’Taq DNAPolymerase③ 引物的延伸： DNA模板 引物結(jié)合物在 Taq DNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對原則，合成一條新的與模板 DNA互補的鏈。Localization of RNA 聚合酶鏈式反應(yīng) (Polymerase Chain Reaction， PCR）216。試分析上述實驗結(jié)果。 （ 1） Southern雜交（ Southern印跡）： 用適當?shù)南拗泼赶郎y DNA，電泳后，將凝膠浸于堿性溶液中以變性 DNA，再經(jīng)毛細作用將變性的DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移至雜交膜上并固定，然后與放射性同位素標記的核酸探針雜交，再經(jīng)放射自顯影顯示雜交結(jié)果。然后與核酸探針進行雜交。 放射性的衰變類型α 射線：帶正電荷的高速粒子流β 射線：帶負電荷的 粒子流γ 射線：光子流216。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。 類 功 到適當?shù)氖荏w細胞中并增殖。2