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原核表達載體(更新版)

2025-09-13 03:30上一頁面

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【正文】 00 rpm離心1 min。⑩ mL滅菌離心管中，在柱膜中央加入60 μl 75℃預熱的ddH2O，室溫放置2 min，12000 rpm離心1 min。構建克隆載體的方法參見上面步驟。vi. 取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，室溫12000 rpm離心1 min。⑧菌種保存取500μl重組菌液加入等體積50%的無菌甘油(終濃度達到25%)，液氮速凍，80℃保存。加2Loading buffer后沸水變性5 min。vii. 收集沉淀，加適量破碎液重懸細胞，300 w超聲波破碎20 min，工作10 s停10 s。分離上清和沉淀，上清直接加等體積2 Loading buffer，沉淀用PBS重懸后，加等體積2Loading buffer，沸水煮5 min變性。 ③檢測重組蛋白可溶性（好像做多克隆抗體不用檢測蛋白可溶性？） i. 將重組菌在含對應抗生素的LB平板上劃線培養過夜。 ②IPTG誘導蛋白表達（這個不確定）i. 將重組菌在含對應抗生素的LB平板上劃線培養過夜。離心管中的液體即為回收的目的基因片段，可立即使用或保存于20℃備用。%瓊脂糖凝膠分離。可立即使用或保存于20℃備用。④加入250 μl SolutionⅡ，輕柔顛倒離心管46次。 ④棄去上清，加入4 mL預冷的含15% mol/L的CaCl2 溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態細胞懸液。⑤重復步驟④一次。原核表達載體（pET30c ？）。先設計好PCR的引物和PCR的反應程序。離心管中的液體即為回收的目的基因片段，可立即使用或保存于20℃備用。Ⅴ. 挑取白色單克隆菌落，重懸于5 μl ddH2O中，取其中1 μl用于PCR鑒定。⑦取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，加入500 μl Wash Solution，室溫12000 rpm離心1 min。 Ⅷ. 重組質粒的目的基因的序列測定重組質粒由測序公司測序。iii. 加入2倍體積solution DEB，顛倒混勻，將溶液轉移到吸附柱中，室溫放置1 min，12000 rpm離心1 min。 ⑥轉化菌的PCR鑒定（菌落PCR） ⑦轉化菌的酶切鑒定：轉化菌菌液擴大培養，提取質粒，雙酶切檢測。iv. 培養完畢后，取1 mL菌液12000 rpm離心，棄上清，200 μl PBS懸浮。iv. 加入IPTG誘導至6 h，4℃，10000 g離心5

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