蛋白質(zhì)化學(xué)ppt課件(2)(專業(yè)版)

　　

【正文】 末端基氨基酸測定 ? 丹磺酰氯法（ dansyl chloride） N ( C H3)2S O2C lH2N C H CR OH N C H CR OS O2N ( C H3)2+水解N ( C H3)2S O2 H N C H CR OO H+ 氨基酸丹磺酰氯多肽 N 端丹磺酰 N 端氨基酸丹磺酰氨基酸pH 8,9 H+, 2. 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定 ? 此法是多肽鏈 C端氨基酸分析法。根據(jù)測得的樣品的相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可以查出樣品的相對分子質(zhì)量。 ? 被結(jié)合的蛋白質(zhì) ，可以用適當(dāng)?shù)南疵撘合础? 3）凝膠中的泳動速度僅取決于分子量的大小，小的快，大的慢。 ? 不同的蛋白質(zhì)由于所帶的電荷和水化程度不同，鹽析時所需的 鹽的濃度 也不相同，因而可以將不同的蛋白質(zhì)加以分離。 蛋白質(zhì)顆粒在具有 密度梯度的介質(zhì) 中離心時，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，且每種蛋白質(zhì)顆粒 沉降到與其自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時 ，即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成不同的區(qū)帶。 ? 所有的分離和純化過程都必須在 溫和的條件下 進(jìn)行 。 方法： 先加入適當(dāng)?shù)?沉淀劑 （如中性飽和硫酸銨溶液、酸、堿等），將蛋白質(zhì)溶液轉(zhuǎn)變成 懸浮液 ，在 不同的離心速度下，使不同大小和密度的蛋白質(zhì)顆粒分離。 ? 帶電顆粒將向著不其電性相反的電極移動。 改變?nèi)芤旱?pH值和鹽離子濃度 —— 結(jié)合力最小的蛋白質(zhì)先洗脫下來。 ? 將蛋白質(zhì)溶液放在超速離心機的離心管中進(jìn)行超速離心。 片段重疊法的大體步驟： （亞基）的拆分； ； ，確定其肽鏈數(shù)目、 N末端、 C末端。此法的特點是能夠丌斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈 N端氨基酸殘基逐一迚行標(biāo)記和解離。 (3)二硫鍵的斷裂 ? Reduction or Oxadation :應(yīng)用 過甲酸氧化法 或 ?巰基乙醇 還原法 拆分多肽鏈間的二硫鍵。當(dāng)用洗脫液洗脫時，被排阻的相對分子質(zhì)量大 的分子先被洗脫下來，相對分子質(zhì)量小的分子后下來。 (五 ) 根據(jù)配體特異性的分離 —— 親和層析 ?親和色譜法 （ Affinity chromatography） —是一種高效分離純化蛋白質(zhì)的方法 ? 在固定相載體表面偶聯(lián)具有特殊親和作用的 配基 ，這些配基可以與流動相中溶質(zhì)分子發(fā)生可逆的特異性結(jié)合而進(jìn)行分離的一種方法，稱之為 親和層析 。因此， Eq值接近一個常數(shù)。 凝膠過濾的原理 凝膠過濾的步驟 （二）根據(jù)溶解度差別的分離方法 ? 等電點沉淀法： ? 蛋白質(zhì)分子在等電點時，凈電荷為零，分子之間的 靜電排斥力最小 ，因而容易聚集形成沉淀。 差速離心法的步驟 ： ? ②粗分級 ? 通常用 鹽析 、 等電點沉淀 、 超濾 、 有機溶劑分級等簡便、處理量大的方法從蛋白質(zhì)混合液中除去大量雜質(zhì)，得到濃縮蛋白質(zhì)溶液。 ? 若所要的蛋白質(zhì)主要存在于某一細(xì)胞組分，如線粒體、葉綠體、細(xì)胞核等，可先用 差速離心法 將其分開，再以該細(xì)胞組分作為下一步分離提純的材料。 ? 這樣根據(jù)丌同大小分子所經(jīng)的路徑丌同而得到分離 : ——大分子最先流出層析柱，小分子后流出。 ? 這樣，每一個蛋白質(zhì)分子都因為結(jié)合了許多的SDS而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。 洗脫液為不同濃度和不同 pH的 磷酸緩沖溶液 。這些網(wǎng)孔只允許 較小的分子進(jìn)入顆粒內(nèi) ，而大于網(wǎng)孔的分子則被排阻。 ? 通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)不蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。 (8)確定肽段在多肽鏈中的次序 利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。 （ 1） N末端分析：