細胞生物學研究方法-文庫吧

【正文】 60 390 紫外光 390 13 X 射線 13 0. 05 γ射線 1 0. 005 電子束 : 100V 0. 12 3 10 ,0 00V 0. 01 22 10 0, 000V 0. 00 387 各種光及電子束的波長 透射 電子顯微 電鏡 電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區別 顯微鏡 分辨本領 光源 透鏡 真空 成像原理 光鏡 電鏡 200nm 100nm 可見光（ 400700） 紫外光 （約200nm) 電子束 () 玻璃透鏡 玻璃透鏡 電磁透鏡 不要求真空 不要求真空 要求真空 ～ 利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化 利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差 電子顯微鏡的分辨本領與有效放大倍數 電子顯微鏡的分辨率可達 ， 其放大倍數為 100萬倍 。上述放大倍數稱之為有效放大倍數；如繼續通過光學手段放大也不會得到任何有意義的信息 ， 因此稱之為 “ 空放大 ” 。 電鏡的分辨本領 : 是指電鏡處于最佳狀態下的分辨率 。 實際情況下 ， 電鏡的實際分辨率常常受到生物制樣技術本身的限制 ， 如在超薄切片樣品中其分辨率約為超薄切片厚度的 1/10， 即通常切片厚度若是 50nm， 其實際分辨率約為 5nm， 遠低于電鏡的分辨本領 。 由于電子束穿透力很弱，因此用于電鏡觀察的標本須制成厚度僅 20－ 50nm 的超薄切片，并放在銅網上。這種切片需要用超薄切片機制作。 1. 超薄切片技術 二、主要電鏡制樣技術： 超薄切片 銅網 取材 :要快，避免損傷，標本必須薄，小 固定 :常用戊二醛和四氧化鋨固定，四氧化鋨除與蛋白共價結合外 ,還對脂類有良好的固定效果。 脫水 :等級梯度脫水，用脫水有利包埋。 包埋 :為制成超薄切片 ,并使切片耐受高真空、電子轟擊 , 切片前需包埋 ,常用環氧樹脂。 切片 :將樣品制成 50～100nm厚的薄片。 染色 :生物分子由原子序數低的輕元素組成 , 散射電子能力弱 , 無明暗反差 ,需進行染色。 常用的染色劑：醋酸鈾、枸櫞酸鉛。 透射電鏡標本制備過程 : 觀察組織、細胞 內部超微結構 。 分辨率 。 標本在熒光屏上呈黑白反差的結構影像。 電子密度高、電子密度低 ：被重金屬浸染呈黑色的結構，稱電子密度高；反之，淺染的部分稱電子密度 用 重金屬鹽 （如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網上的樣品 進行 染色 ；吸去染料，樣品干燥后，樣品 凹陷處 和 樣品周圍 鋪 了一薄層重金屬鹽，而 凸出處 則沒有染料沉積，從而出現負染 效果，分辨力可達 。 示 肌動蛋白纖維 二 負染色（ negative staining）技術 Figure 329. Electron micrograph of negatively stained actin filaments. Each filament is about 8 nm in diameter and is seen, on close inspection, to be posed of a helical chain of globular actin molecules. (Courtesy of Roger Craig.) V. Negative Staining and Cryoelectron Microscopy Allow Macromolecules to Be Viewed at High Resolution 亦稱冰凍斷裂 (freezefracture)， 是研究生物膜內部結構的一種有用的技術 ， 關于膜結構的許多資料即是利用這種方法取得的 。 冰凍斷裂技術也是研究細胞內部各種細胞器結構的有用手段 。 三 冰凍蝕刻技術 ① 將標本于 100℃ 干冰中或 196℃ 液氮中，超低溫冰凍。 冰凍蝕刻技術的操作步驟 : ② 然后用冷刀驟然將標本沖斷開 ， 升溫后冰在真空條件下迅即升華 ， 細胞內外凡含水多的地方因失水而下陷 ,暴露出了斷裂面的 膜和其它一些結構 ,增強了斷面的浮雕效果－蝕刻 。 ③ 標本蝕刻后， 再向斷裂上以 45176。 噴金 , 90176。 噴碳后 將樣品浸泡于腐蝕液中將生物組織腐蝕掉，只剩下鉑－碳復型膜。 ④ 復膜顯示出了標本蝕刻面的形態 ， 撈于載網上干燥后可置于透射電鏡下觀察 。 電鏡下的影像即代表標本中細胞斷裂面處的結構 。 復膜 細胞冰凍斷裂后的電鏡圖像 ? 20世紀 60年代問世，用來觀察標本表面結構。 ? 分辨力為 6~10nm，由于人眼的分辨力（區別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為 ，掃描電鏡的有效放大倍率為 20220X。 （二）掃描電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡原理 工作原理： 是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結構有關，次級電子由探測器收集，信號經放大用來調制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。 掃描電子顯微鏡 生物樣品制備的基本操作程序 掃描電鏡照片展示 不同倍率的果蠅掃描電鏡照片 掃描電鏡照片展示 可以用計算機將黑白照片處理成彩色 掃描電鏡照片展示 人類精子 （三）掃描隧道顯微鏡 Scanning Tunneling Microscope， 分辨率： XY向 （原子級分辨率） 掃描隧道顯微鏡是用來顯示物質表面原子排布的一種顯微鏡，它是根據量子力學中的隧道效應而設計的。 掃描隧道顯微鏡原理 示意圖 探針和物體之間加上電壓。如果探針距離物體表面很近 —— 大約在納米級的距離上電子會穿過物體與探針之間的空隙，形成一股微弱的電流。如果探針與物體的距離發生變化，這股電流也會相應的改變。這樣，通過測量電流我們就能知道物體表面的形狀， 原子級高分辨率 。 如 STM在平行和垂直于樣品表面方向的分辨率分別可達 ， 即可以分辨出單個原子 ， 具有原子級的分辨率 。 可在真空 、 大氣 、 常溫等不同環境下工作 ， 甚至可將樣品浸在水和其它溶液中 ， 不需要特別的制樣技術 ， 并且探測過程對樣品無損傷 。 這些特點適用于研究觀察生物大分子 (