腎內(nèi)科臨床技術(shù)操作規(guī)范-文庫(kù)吧

【正文】 術(shù)數(shù)小時(shí)前準(zhǔn)備完畢，并將其置于冰箱內(nèi)備用?！救〔呐袛唷拷?jīng)皮腎活檢術(shù)所獲取的腎組織一般包括以下幾種成分：皮質(zhì)組織、皮髓交界組織以及皮質(zhì)一髓質(zhì)一皮質(zhì)組織。穿刺取得腎組織后，立即用生理鹽水沖洗數(shù)次以除血跡。1．迅速判斷所取組織是否為腎組織，還是其他類(lèi)型的組織，如肌肉組織、結(jié)締組織、脂肪組織等。2．當(dāng)確定為腎組織后，立即將組織置于蠟板上，迅速測(cè)量其長(zhǎng)度(mm)，并記錄。 3．用解剖顯微鏡或放大鏡進(jìn)行觀察，以區(qū)別皮質(zhì)和髓質(zhì)，并仔細(xì)觀察標(biāo)本是否有腎小球。在解剖顯微鏡下，腎皮質(zhì)色較淡，皮質(zhì)區(qū)可見(jiàn)一些分布不規(guī)則，朦朧的紅色小點(diǎn)，此即腎小球。使用解剖顯微鏡可大大幫助區(qū)別組織，作出正確的判斷。但隨著經(jīng)驗(yàn)的積累，也可用肉眼判定。4．要使腎活檢診斷的可靠，所取標(biāo)本的量是至關(guān)重要的。如無(wú)腎小球或皮質(zhì)部分少于1 ml，要考慮再次穿刺，取得的組織要迅速分切后固定。【標(biāo)本分切】用國(guó)產(chǎn)18號(hào)Menghini型穿刺針(針長(zhǎng)15cm，內(nèi)徑1．4mm)取得的腎組織粗細(xì)適中，一次取得組織以1．5～2．Ocm為最佳。組織取出后用小鑷子將組織輕輕地夾到蠟板上，鏡下觀察，量出長(zhǎng)度，用銳利的刀片將組織間隔切成1mm、2mm及4mm長(zhǎng)的數(shù)段，分別供電子顯微鏡、免疫熒光、免疫酶標(biāo)、光學(xué)顯微鏡檢查用。首先分取電鏡標(biāo)本，要求組織少而精，取皮質(zhì)區(qū)lmm長(zhǎng)度即可，要求腎小球至少1個(gè)；其次分配免疫病理檢查所需組織，約2mm，要求腎小球至少3～5個(gè)；其余組織留作光鏡檢查用，要求腎小球至少10個(gè)。【標(biāo)本處理】1．免疫熒光及免疫酶標(biāo) 將分切后的組織迅速放人事先冷藏的培養(yǎng)皿內(nèi)的濕紗布中，置人冰瓶立即送至恒溫冷凍切片機(jī)內(nèi)(一30℃)進(jìn)行包埋、切片。如果不能馬上切片，標(biāo)本必須立即保存于一40～一70~c低溫冰箱內(nèi)，以保持抗原活性，防止抗原移位或流失，但在低溫冰箱內(nèi)放置時(shí)間不宜超過(guò)2d。2．光鏡 將分切后的組織平放在蠟板上，勿使其扭曲，用小鑷子蘸少許光鏡固定液于組織表面，30s左右使組織稍稍硬直后，再將整條組織放人固定液內(nèi)。這樣固定的組織平整、不易彎曲，便于切出完整的切片。3．電鏡 將分切后的組織立即放人2．5％戊二醛固定液中，置于冰瓶?jī)?nèi)送至電鏡室?！咀⒁馐马?xiàng)】1．觀察和分切標(biāo)本應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)完成，并注意保持腎組織濕潤(rùn)，切勿使其干涸。2．在解剖顯微鏡下觀察組織時(shí)，光線不宜太強(qiáng)，否則組織容易干涸，腎小球也不易看清。3．供免疫熒光檢查用的腎組織應(yīng)避免接觸固定液，特別是含乙醇的固定液，以免影響冰凍切片檢查結(jié)果。電鏡固定液和光鏡固定液不得互相混入。4．組織未經(jīng)固定前，鑷子夾取組織的動(dòng)作要輕，勿牽扯組織，避免人為因素造成組織細(xì)胞變形。 二、腎活檢標(biāo)本光鏡檢查的制備技術(shù)【組織固定】1．固定液的選擇 進(jìn)行組織學(xué)檢查，一般用4％甲醛(即10％福爾馬林)溶液，但是腎活檢標(biāo)本常常需要進(jìn)行多種特殊檢查及染色，因此應(yīng)選擇一種能夠適用于各種特殊染色的固定液。升汞一苦味酸混合固定，不但可以進(jìn)行常規(guī)染色和各種特殊染色，還可進(jìn)行酶標(biāo)抗體染色。2．固定要求 腎活檢取得標(biāo)本后，立即平鋪在小蠟板上，迅速以鋒利的刀片將組織按規(guī)定分配，并立即用固定液固定標(biāo)本。如用戊二醛固定，固定時(shí)間最好不超過(guò)2h；如為多聚甲醛固定，時(shí)間稍長(zhǎng)無(wú)妨。3．固定液配制(1)升汞一福爾馬林(用時(shí)將a、b液混合，搖勻) a．飽和氯化汞 4．5ml(1％NaCl) b．甲醛 0．5ml(2)取2．5ml Db液，配方如下：80％飽和苦味酸乙醇溶液 25m1純乙醇 220ml甲醛 120ml蒸餾水 50ml組織取好后，先放人升汞一福爾馬林液中10min左右，再將組織取出，放人Db液中固定。【前期處理】1．脫水處理75％乙醇 10min2次90％伊紅乙醇 10min95％乙醇 10min優(yōu)質(zhì)無(wú)水乙醇 10min2次2．透明 用擦鏡紙將組織包埋后，放人氯仿中10min2次。3．浸蠟蠟缸工 30min蠟缸Ⅱ 60min4．包埋5．切片(1)普通切片：厚度為1～2 μm，烤片溫度為60186。C，時(shí)間10min。(2)銀染切片：厚度與普通切片相同，烤片溫度需90186。C，時(shí)間為40min?！咎K木精一伊紅染色(HE染色)】HE染色是觀察組織病變與否的最基本染色。1．切片常規(guī)脫蠟入水。2．蘇木素染細(xì)胞核1～2min。3．水洗后1％鹽酸分化(過(guò)一下)。4．流水沖洗，鏡下觀察細(xì)胞核已經(jīng)染成藍(lán)色，其余組織呈灰色。5．放置伊紅染液中20min左右。6．如基底膜偏紅可在75％乙醇缸中過(guò)一下。7．乙醇脫水，二甲苯透明封片。蘇木素染液配制：將蘇木素溶于乙醇，傾人明礬液中，混合后蒸沸，加入一氧化汞1．0g，用玻棒攪拌均勻，當(dāng)溶液呈深紫色時(shí)，立即移人冷水中，促使冷卻，靜置過(guò)夜，過(guò)濾封閉保存，用前若加5％醋酸則染色更佳。一般新鮮配制時(shí)染2～5min。蘇木素 0．9g氧化汞 0．5～1．Og純乙醇 10mlHAC 12～13mi硫酸鋁鉀銨(鉀明礬) 20g甘油 10ml／100ml蒸餾水 200ml伊紅乙醇配制：將伊紅溶解后，用滴管滴人醋酸使呈糊狀，加數(shù)升蒸餾水即可過(guò)濾，將濾出的沉渣在烤箱中烤干，溶于95％乙醇200ml中，即可用。伊紅(曙紅Y) 1．Og蒸餾水 10m1【PAS染色】過(guò)碘酸一席夫染色(PAS染色)將腎小球基底膜、腎小管基底膜以及系膜基質(zhì)染成紫紅色。1．切片常規(guī)脫蠟入水。2．1％過(guò)碘酸氧化15min。3．水洗后，過(guò)蒸餾水。4．放置席夫試劑(Schiff試劑)染色5～10min。5．流水沖洗10min以上(觀察組織由淡紅色轉(zhuǎn)為玫瑰紅色)。6．蘇木素淡染30s～2min。7．水洗藍(lán)化(必要時(shí)分化)。8．乙醇脫水，二甲苯透明封片。席夫(Schiff)液配制：將蒸餾水煮沸冷卻至80℃，溶人堿性品紅，冷卻后過(guò)濾，至60186。C時(shí)加鹽酸，25186。C時(shí)加偏重亞硫酸鈉，黑暗中儲(chǔ)放過(guò)夜，加入藥用炭，搖lmin后過(guò)濾，4186。C暗色瓶中備用。配方：堿性品紅1g、偏重亞硫酸鈉2g、lmol／L(1N)鹽酸20ml、藥用炭2g、蒸餾水200ml。【馬森三色染色】馬森(Masson)三色染色將細(xì)胞核染成黑色，胞漿及膠原纖維染成藍(lán)綠色，蛋白、免疫復(fù)合物染成橘紅色。1．切片常規(guī)脫蠟入水。2．天青石藍(lán)染細(xì)胞核10min，水洗藍(lán)化。3．1％醋酸水溶液lmin。4．馬森(Masson)紅染液10min左右。5．1％醋酸水溶液lmin。6．O．5％亮綠，光鏡下控制，使腎小球基底膜變綠。7．快速脫水(甩片)，透明封片。馬森(Masson)紅染液配制：變色酸2R(chicmolocps 2R) 0．6g亮綠SF 0．3g蒸餾水 100ml磷鎢酸 0．8g冰醋酸 1．0ml【PAM染色】 PAM染色將腎小球基底膜、腎小管基底膜以及系膜基質(zhì)染成黑色，而免疫復(fù)合物染成紅色。1．切片常規(guī)脫蠟入水。2．脫汞：30％含碘(3％)乙醇5min。3．脫碘：5％硫代硫酸鈉5min。4．蒸餾水沖洗7～8次。5．六胺銀染色，75186。C，30～45min。6．蒸餾水沖洗。7．3％硫代硫酸鈉2～5min。8．清水沖洗。9．1％醋酸中過(guò)一下。10．混合紅1h。11．1％醋酸水洗。12．1％淡綠，光鏡下控制。13．快速脫水(甩片)，透明封片。六胺銀液配制：用時(shí)現(xiàn)配預(yù)溫蒸餾水 23ml5％硼砂 4．5ml4％硼酸 O．2～0．4ml15％六次甲基四胺 6ml10％硝酸銀 0．7～0．75ml混合紅液配制：馬森(Masson)紅染液中加入少許1％酸性品紅，比例需染片后定?！綧SB染色】細(xì)胞核呈黑色；紅細(xì)胞呈黃色；蛋白呈紅色；結(jié)締組織呈藍(lán)色。1．切片脫蠟入水。2．用天青藍(lán)染細(xì)胞核。3．水沖洗。4．分化核(試劑：分化液中含0．25％鹽酸，70％乙醇)。 ．5．水沖洗。6．過(guò)95％乙醇，然后用0．5％馬休黃染[O．5％馬休黃(martius yellow)，95％乙醇，2％磷鎢酸]2min。7．蒸餾水洗，然后用1％麗春紅6R(brilliant crystal scarlet，1％麗春紅6R，2．5％醋酸)染色10min。8．用蒸餾水沖洗，再用1％磷鎢酸做固定分化紅色染料5min。9．0．5％苯胺藍(lán)(soluble blue，0．5％苯胺藍(lán)，1％醋酸)染10min。10．1％醋酸洗，吸干，純乙醇脫水，二甲苯透明，封片。【高錳酸鉀一堿性剛果紅染色】細(xì)胞核藍(lán)色，淀粉樣物質(zhì)呈淡紅色。1．切片脫蠟入水。2．高錳酸鉀一硫酸混合液(5％高錳酸鉀，0．3％硫酸，用時(shí)現(xiàn)配，等量混合)處理3min，水洗。3．5％草酸3min，水洗。4．蘇木素染核2min，水洗，藍(lán)化。5．堿性剛果紅液(1％NaOH 0．3ml，80％乙醇氯化鈉剛果紅飽和溶液30m1)中10～20min。6．快速脫水，透明，封片。注意：切片厚度以4～6μm為好。此種染色是在堿性剛果紅染色(去掉第二和第三兩個(gè)步驟)陽(yáng)性基礎(chǔ)上進(jìn)行的，以此辨別蛋白的性質(zhì)：經(jīng)高錳酸鉀處理后依然陽(yáng)性的切片為AL蛋白沉積；陰性的切片為AA蛋白沉積。三、腎活檢標(biāo)本免疫化學(xué)及免疫熒光染色的制備技術(shù)【免疫化學(xué)染色試劑】1．pH7．4 0．01mol／L磷酸鹽緩沖液(PBS)(用于稀釋抗體，沖洗切片)A液0．2mol／L Na2 HP04：Na2 HP0412H20 35．82g／500ml蒸餾水B液0．2mol／L N a2HP04：Na2HP0412H20 15．6g／500ml蒸餾水A液40．5ml，B液9．5ml，加8．8g NaCl，蒸餾水(DW)稀釋至1 000ml2．pH7．2 0．15mol／L PBS緩沖液(洗液)Na2 HPOa12H20 96．695gKH2P04 7．145gNaCl 10．625g蒸餾水溶解至5 000ml3．pH 7．6 0．05mol／L Tris—HCl緩沖液0．2mol／L Tris：稱取三羥甲基氨基甲烷24．3g，加DW溶液至1 000mlO．1mol／L HCl：濃HCl 8．8ml加水至1 000ml0．1mol／L HCl 389ml，加入O．2mol／L Tril 250ml，再加DW至1 000ml4．3．3’二氨基聯(lián)苯胺(DAB)一H202顯色液3mg DAB加5ml pH7．6 O．05mol／L Tril—HCI緩沖液溶液，加8μ1 3％H202，充分混勻，臨用前配制。5．蘇木素染液蘇木素 1g無(wú)水乙醇 10ml鉀明礬(硫酸鋁鉀) 20g蒸餾水 200ml氧化汞 1g冰醋酸 12ml甘油 10ml／500ml配制時(shí)先將明礬溶解，再將蘇木素溶于乙醇傾人明礬液中，混勻后用火煮沸，加入氧化汞1g，以玻璃棒攪至深紫色立即移人冷水，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，加入甘油密封保存，用時(shí)加人冰醋酸?！灸I組織免疫熒光染色(直接法)】1．腎組織冰凍切片吹干。2．加適當(dāng)稀釋度抗體異硫氰熒光素(FITC)(IgG、IgA、IgM、CCClq)，置濕盒室溫40min。3．取出后流水沖洗，吹干。4．熒光顯微鏡下鏡檢。 5．若需照相，用50％緩沖甘油(0．5 mol／L碳酸鹽緩沖液pH9．O～9．5)封固。【腎組織免疫酶標(biāo)染色】1．冰凍切片直接免疫酶標(biāo)染色法(1)3μm冰凍切片未經(jīng)固定，電風(fēng)扇吹干。 、(2)加適當(dāng)稀釋度辣根過(guò)氧化酶(HRP)一抗體(IgG、IgA、IgM、CCClq、HBS)置濕盒37176。C 40min。(3)取出后流水沖洗，pH7．2 0．15mol／L PBS洗3次，吹干。(4)浸入(或滴加)DABH2O2顯色5min，水洗。(5)蘇木素復(fù)染，水洗吹干后封片鏡檢。2．冰凍切片過(guò)氧化酶一抗過(guò)氧化酶復(fù)合物(PAP)四層法(1)充分吹干切片，冷丙酮固定10min，吹干。(2)10％小牛血清室溫作用20min。(3)去除多余液體，加工作濃度單克隆抗體室溫孵育1．5h。(4)pH 7．4 0．04mol／L PBS充分沖洗。(5)加HRPRAM 1：100抗體，室溫40min[稀釋液同(5)]。(6)洗片同(4)。(7)加1：50兔PAP室溫40min。(8)洗片同(4)。(9)加DAB H2O2顯色液，鏡下觀察控制顯色時(shí)間，流水洗去顯色液，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，水洗。(10)吹干，樹(shù)膠封片。3．結(jié)果判斷(1)腎小球：觀察并記錄腎活檢切片中所有腎小球中陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)，再以此總數(shù)除以每份切片中腎小球個(gè)數(shù)，得出每個(gè)腎小球內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)平均值，同時(shí)分別記錄球內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞最高值、最低值。(2)腎間質(zhì)：15倍目鏡中加25格測(cè)微器，在40倍鏡下，參照血細(xì)胞計(jì)數(shù)板算得每平方毫米內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。(3)腎