《植物細胞工程課程》ppt課件-文庫吧

【正文】 超微結構與生物化學 （一）胚性細胞的超微結構 核增大，細胞器數量增多： 特別是線粒體 (mitochondrion) 數量明顯增加。 愈傷組織圓形薄壁細胞的核增大 ,核仁著色深 ,一般具 有兩個以上的核仁，大液泡消失，細胞質電子密度明顯加強，質體 plastid),核糖體 (ribosome)，特別是線 粒體 (mitochondrion) 數 量明顯增加 ,同時核糖體不僅數量增加 ,而且聚集成多聚核糖體 (polyriBosome or polysome)。 2. 廣泛存在著胞間連絲 (plasmodesmata)： 早期胚性細胞與周圍細胞間還存在廣泛的胞間連絲通過胞間連絲傳遞物質和信號，為胚性細胞的進一步分化與發育奠定了基礎。 紅豆衫細胞聚集體 3. 細胞膜上有分泌泡的形成： 其內含一些被消化的細胞器和殘渣。 ，核偏移 ,細胞壁加厚，細胞器持續增加： 隨著胚性細胞的發育 ,細胞拉長，核偏移 ,細胞壁加厚，線粒體（ M）數目進一步增加 ,常連片分布于細胞質中 ,既有大量游離核糖體 ,又有多聚核糖體存在 ,并出現高爾基體 (golgibody)和微管 (microtu bule)等。 ● 小麥體細胞胚微結構的變化 小結 ?體細胞胚胎發生的脫分化與再分化。 ?體細胞胚胎發生過程與合子胚類似，第一次分裂多為不均等分裂，也有近似的均等分裂。但 胚性細胞發生具有明顯的不同步性。 ?胚性細胞核增大， 偏移 ,細胞器數量增多， 特別是線粒體 數量明顯增加。細胞壁加厚，且 存在著胞間連絲。 （二）體細胞胚發生的生物化學 ATPase增高并逐漸 由質膜轉入細胞內 ● 推測：胚性細胞是通過外 源激素的誘導而啟動的。因 為外源激素作用的部位是質 膜，首先誘導膜蛋白的合 成，于是導致 膜 ATP酶 活性 提高。 后期 ： ATP酶活性從細 胞質膜逐漸轉入細胞內， 并在細胞壁的加厚處也出 現 ATP酶活性反應的沉積 物。 ● 推測：處于 “ 生理隔離 ”晚期的胚性細胞或胚性細胞團一直處于一個 厚壁包圍 之中，與其周圍細胞之間的胞間連絲也消失。 ATP酶的廣泛存在和保持較高活性為胚性細胞或原胚的一系列代謝提供了能量保證。 2. 蛋白質含量升高 ● 胚性愈傷組織蛋白質含量遠高于非胚性愈傷組織； ● 體細胞 胚 的可溶性蛋白質含量高于胚性愈傷組織； ● 體細胞胚發育過程中，蛋白質含量高低依次為：（ 181。g ） ● 以成熟胚為單位 ,可溶性蛋白質含量隨胚體的增加而升高。 球形胚 梨形胚 香蕉形胚 子葉分化期胚 成熟胚 103 103 103 103 103 淀 粉 粒 初期 發育中的 二細胞 多細胞 球形胚 成熟胚 胚性細胞 胚性細胞 原胚 原胚 ? 小麥體細胞胚發生過程中淀粉粒消長動態與小麥合子胚基本一致； ? 單子葉與雙子葉植物體細胞胚發生過程中淀粉粒消長動態趨勢相似； 應用 3H胸苷 (3H dT)標記 ,放射自顯影方法研究表明 :愈傷組織轉入 “ 胚發生培養 ” 4h后，標記的細胞數和標記量逐漸增加，到 “ 球形胚 ” 時 DNA合成速率達到最高峰 . ● 隨著體細胞胚的發育 ,DNA合成明顯增加 : 8 8 2 2 (1) 胚性愈傷組織 (EC)的內源激素含量遠高于非胚性愈傷組織 (NEC)； (2)胚性細胞中內源 GA水平較低，非胚性細胞中較高。 GA可能對體細胞胚發生有負作用； (3) ABA/IAA和 ABA/GA的比值一直是 EC高于NEC，顯然豐富的內源激素含量，可能是體細胞脫分化并形成胚性細胞和保持胚胎發生能力不可缺少的因素； (4) 補加適量的外源 ABA（ 4181。mol L1），可明顯提高體細胞胚發生的頻率與質量（促進發生和抑制畸形胚）。 (5) ABA合成抑制劑不僅降低內源 ABA 含量 ,而且抑制體細胞胚胎發生。 167。 34 體細胞胚的起源與遺傳穩定性 一 . 體細胞胚的起源 1. 絕大多數體細胞胚是起源于單細胞，證據： ● 從多種植物中都觀察到單個的胚性細胞、均等分裂的和不均等分裂的二細胞原胚； ● 在一塊愈傷組織中或一張切片上可觀察到多個不同發育時期的體細胞胚。 ● 在紅豆草單細胞懸浮培養中也觀察到單個胚性細胞具有明顯 極性 ，第一次分裂多為 不等分裂 ，頂細胞繼續分裂形成多細胞原胚，基細胞進行少數幾次分裂形成胚柄。 ● 在石防風懸浮培養的體細胞中也觀察到 無絲分裂 ，其中多為縊縮分裂，形成兩個細胞核； ● 3H胸苷 (3HdT)標記實驗表明 ,開始是愈傷組織外層少數細胞被標記。接著另一些薄壁細胞被標記，這部分的細胞從形態上相繼轉變為胚性細胞。 用同位素脈沖標記實驗可以證明，一些形成的胚性 細胞團也是由一個單細胞連續分裂而形成的。當然也 不排除有些植物的體細胞胚的確是起源于多細胞的， 有待深入研究。 3. 體細胞轉化為胚性細胞的漸變理論 即一個細胞系的發生與形成是一個特定基因組中 基因活化的結果： ● 一是預定階段，即細胞在脫分化時基因所處的 特殊狀態（預定性）； ● 二是表達階段，在適合的 誘導條件下 ,預定的細胞發生一系列的生理生化和形 態上的變化 ,表現出分化的特性。這一特性是不穩定 的。 預定階段 培養基成分，尤其是激素的種類與水平，決定了外植體基因活動的水平。 基因活動的水平決定生理生化變化的范圍與程度。 表達階段 生理生化變化的范圍與程度，決定外植體形態發生的質量。 預定階段 表達階段 通過調節培養基成分、激素組成與配比繼續進行誘導 二 .極性與生理隔離 “ 雙極性 (double polarity)”： 垂周分裂和平周分裂 極性分化的誘導因素：植物激素和外界刺激引起 不均等分裂和基因表達產物的不均勻分布： ● 合子在休眠期中，細胞質和細胞核都集中在一端 , 形態發生顯著的變化。 ● 小麥的胚性細胞的細胞核和質向一端偏移 , 細胞器、核糖體和質體等都有區域性集中分布現象 ,并和細胞核偏移的方向一致。 ● 紅豆草體細胞胚、胡蘿卜體細胞胚發生中， DNA和 RNA的合成同樣具有極性化集中區域。 (physiological isolation)： 即胚性細胞與周圍細胞或組織形成明顯界限的現象。 “ 細胞生理隔離 ” 與 “ 組織生理隔離 ” ？ ● 合子胚： ◆ 被子植物的胚囊減數分裂后 ,形成的大孢子是與周圍細胞處于分開的狀態。 ◆ 在小孢子發生時 ,小孢子母細胞在減數分裂前期也與絨氈層的細胞間沒有聯系。 ● 體細胞胚： ◆ Steward從胡蘿卜體細胞胚胎發生中同樣觀察到與母體組織或外植體的維管束系統無直接聯系，處于相對獨立的狀態。 ◆ 多種植物中都觀察到 ,早期的胚性細胞與周圍細胞還存在胞間連絲 ,但隨著胚性細胞的發育 ,細胞壁加厚 ,胞間連絲消失或被堵塞。胚性細胞開始分裂 ,從二細胞原胚到多細胞原胚始終被厚壁所包圍 ,與周圍細胞形成明顯的界限。 胚性細胞形成后，并不是所有的都能進一步發育 成體細胞胚，這里除了培養誘導條件外，細胞間的 相互作用與競爭是重要的因素。 只有那些從周圍細胞獲得能量、物質的那些胚性 細胞才可繼續分裂和分化： ● 證據： 在這些胚胎迅速發育過程中，相鄰細胞逐漸處于 解體狀態，以致在體細胞胚周圍出現較大的縫隙， 與其鄰近細胞隔離開處于相對獨立的情況。 因而如何改善條件 ,減少細胞間相互競爭作用是提 高體細胞胚發生頻率的重要途徑。 由此推測 ,在胚性細胞的發生與發育過程中處于相對獨立狀態 ,有利于胚胎發生潛力的表達。但生理隔離也只是相對的 ,并不意味著它們與周圍組織在生理上完全隔離開 ,在體細胞胚發生與發育過程中 ,必須從周圍細胞中取得營養、能量和激素等 ,不僅有相互依存關系 ,而且有相互競爭的關系。 生理隔離可能是營養競爭的結果。 三 .遺傳穩定性與變異性 ： 一般認為 ,通過體細胞胚發生途徑形成再生植株是 相對穩定的。理論依據是： ◆ 只有那些未經過畸變的細胞才有可能形成體細胞胚。 ◆ 人工種子的制作 ,優良種質的保存和無性系繁殖等 ,正是基于體細胞胚的基因型與原親本的相同性。 2. 變異性發生的普遍性 ◆ 小麥幼胚作為外植體 ,通過體細胞胚發生途徑建立體細胞無性系 ,在其后代中出現廣泛的變異 ,包括單基因控制的質量性狀變異 ,如粒色、蠟性和穎色變異 。多基因控制的數量性狀變異 ,如株高、抽穗期變異等。 ◆ 寧夏枸杞葉片離體培養形成的再生植株根尖細胞染色體發生明顯變異。 ◆ 無性系的變異是極其廣泛的： 五種不同愈傷組織的染色體變異 愈傷組織來源 觀察細胞數 變異細胞數 變異頻率 (%) 變異范圍