氨基酸發酵工藝學ppt課件(已修改)

　

【正文】 第三章 氨基酸發酵工藝學 學習氨基酸發酵工藝學的目的、研究對象、任務及內容 氨基酸發酵是典型的代謝控制發酵 ， 由發酵所生成的產物 ——氨基酸 ，都是微生物的中間代謝產物 ， 它的積累是建立在對微生物正常代謝的抑制 。在脫氧核糖核酸 (DNA)的分子水平上改變 、 控制微生物的代謝 ， 使有用產物大量生成 、 積累 。 以探討氨基酸發酵工廠的生產技術為主要目的 。 氨基酸的生產以發酵為主 ， 發酵過程的控制是整個生產的關鍵 ， 產物的提純及設備選用當否 ，也會影響產物得率 。 氨基酸發酵工藝學研究的對象應該包括從投入原料到最終獲得產品的整個過程 ， 其中有微生物生化問題 、 生化工程問題 ， 也有分析與設備問題 。 今后的發展是采用誘變、細胞工程、基因工程的手段選育出從遺傳角度解除了反饋調節和遺傳性穩定的更理想菌種 ， 提高產酸 ； 采用過程控制 ，優化工藝進行連續、自動化生產獲得穩產高產；探求新工藝、新設備 ,以提高產率；研究發酵機制問題 ， 以便能更好地控制氨基酸微生物中間代謝產物的發酵。 緒 論 第一節、氨基酸概論 氨基酸簡介 – 構成蛋白質的基本分子單元。 –α 碳原子分別以共價鍵連接氫原子、羧基和氨基及側鏈。側鏈不同，氨基酸的性質不同。 – 目前世界上可用發酵法生產氨基酸有 20多種。 N H 3 C HC O O HRC HN H 2 C O OR+氨基酸的用途 （ 1）食品工業： 強化食品：賴氨酸，蘇氨酸，色氨酸于小麥中 增鮮劑：谷氨酸單鈉和天冬氨酸 苯丙氨酸與天冬氨酸可用于制造低熱量二肽甜味劑 (α 天冬酰苯丙氨酸甲酯 ),此產品 1981年獲 FDA批準 ,現在每年產量已達數萬噸。 （ 2）飼料工業： 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造動物飼料 ，添加蛋氨酸、賴氨酸、精氨酸等必須氨基酸可促進動物生長發育、改善肉質、節省蛋白飼料、降低成本等。 （ 3 ）醫藥工業： 多種復合氨基酸制劑可通過輸液治療營養或代謝失調 氨基酸注射液由 1985年的 100萬瓶增長到 2022的 ，每年以 1520%的速度遞增，全行業的年產值預計能達到10億元 苯丙氨酸與氮芥子氣合成的苯丙氨酸氮芥子氣對骨髓腫瘤治療有效 ,且副作用低。 （ 4）化學工業： 谷氨基鈉作洗滌劑 ,丙氨酸制造丙氨酸纖維（合成高分子化合物）。能保持皮膚濕潤的潤膚劑 ——焦谷氨酸鈉和質量接近天然皮革的聚谷氨酸人造革，以及人造纖維和涂料。 表 38 世界氨基酸主要生產廠家生產能力 品名 廠家 生產能力 品名 廠家 生產能力 蛋氨酸 日本曹達 20220 谷氨酸 味之素 60000 蛋氨酸 日本住友化學 5000 谷氨酸 日本旭化成 15000 蛋氨酸 日本化藥 2500 谷氨酸 協和發酵 15000 蛋氨酸 德國迪高沙 85000 谷氨酸 日本武田藥品 15000 蛋氨酸 法國 AEC 105000 色氨酸 味之素 100 蛋氨酸 美國孟山都 45000 色氨酸 昭和電工 200 蛋氨酸 墨西哥阿爾拜梅克斯 5000 色氨酸 三井東壓 100 蛋氨酸 西班牙 Sodeti 4000 色氨酸 田造制藥 50 蛋氨酸 蘇聯 Volgograd 4000 色氨酸 日本化藥 50 色氨酸 協和發酵 50 賴氨酸 日本味之素 55000 甘氨酸 日本有機合成化學 6000 賴氨酸 日本協和發酵 20500 甘氨酸 協和發酵 5000 賴氨酸 日本東麗 6500 甘氨酸 日本化藥 1000 賴氨酸 南朝鮮味元 10000 丙氨酸 武藏野化學研究所 —— 丙氨酸 日本化藥 —— 氨基酸的生產方法 ? 發酵法： 直接發酵法：野生菌株發酵、營養缺陷型突變發酵、抗氨基酸結構類似物突變株發酵、抗氨基酸結構類似物突變株的營養缺陷型菌株發酵和營養缺陷型回復突變株發酵。包括 添加前體發酵法 ：如用鄰氨基苯甲酸，生產 L色氨酸；甘氨酸生產 L絲氨酸。 ? 酶法： 利用微生物細胞或產生的酶來制造氨基酸。延胡索酸和銨鹽為原料，經天冬氨酸酶催化生產 L天冬氨酸。 ? 提取法 ：常用毛發、血粉等蛋白質原料水解，從中提取。如胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 ? 合成法：合成法獲得 DL蛋氨酸、不對稱合成法獲得 L氨基酸。如丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。 傳統的提取法、酶法和化學合成法由于前體物的成本高，工藝復雜，難以達到工業化生產的目的。 第二節、氨基酸發酵菌株的育種 是氨基酸代謝控制發酵的基本策略之一 ? 發酵工程要求微生物大量地合成特定的代謝產物，這一目的只有當微生物的部分代謝調控機制遭到破壞時才能達到。用人工誘變的方法有目的地改變微生物固有的調節機制，使合成產物的途徑暢通無阻，最大限度地積累特定產物，這種發酵稱為代謝控制發酵。 用野生菌株的方法 ? 分離的野生菌株具備積累產物的特性，可用于直接發酵（產率低）。如谷氨酸發酵。 ? 通過轉換發酵，可延伸獲得其它產物。主要采用改變培養條件。如谷氨酸發酵中改變銨離子濃度、磷酸濃度，使谷氨酸轉向谷氨酰胺和纈氨酸發酵。 2. 用營養缺陷變異株的方法 ? 通過誘變出菌體內氨基酸生物合成某步反應阻遏的營養缺陷型變異體，使生物合成在中途停止，不讓最終產物起調控作用。 ? 如用高絲氨酸缺陷株的賴氨酸發酵，谷氨酸缺陷株的鳥氨酸發酵，異亮氨酸缺陷菌株的脯氨酸發酵。 谷氨酸棒狀桿菌的蘇氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸的合成是與分枝途徑相聯系的 (圖 48)，篩選高絲氨酸營養缺陷型后，限量供給蘇氨酸時，就能解除由蘇氨酸和賴氨酸的協同反饋抑制作用，而獲得賴氨酸的過量生產。這是因為僅有賴氨酸或蘇氨酸存在時，天冬氨酸激酶不被抑制，只有兩者的協同效應才能造成抑制。在限量供給蘇氨酸的情況下，即使賴氨酸過剩，抑制作用也很難發生。 3. 類似物抗性變異株的方法 ? 用一種與自己想獲得的氨基酸結構相類似的化合物加入培養基內，使其發生控制作用，從而抑制微生物的生長。這樣，就可以得到在這種培養基中能夠生長的變異株，而這種變異株正是解除了調控機制的，能夠生成過量的氨基酸。 ? 利用此方法發酵的有 :蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、組氨酸和精氨酸。 高絲氨酸脫氫酶 ? 例如，在黃色短桿菌的賴氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸生物合成中（圖 516所示），選育抗蘇氨酸結構類似物 2氨基 3羥基戊酸（ AHVr）突變株，得到了具有反饋抑制抗性，高絲氨酸脫氫酶活性提高 1300倍，能積累 14g/L蘇氨酸的突變株。 4. 體內及體外基因重組的方法 ? 基因工程包括細胞內基因重組方法和試管內的體外基因重組方法。 ? 體內基因重組在應用上又稱為雜交育種，主要方法包括：轉化、轉染、接合轉移、轉導和細胞融合等，這都是在細胞內暫時地產生染色體的局部二倍體，在兩條 DNA鏈之間引起兩次以上的交叉，是遺傳性重組現象。 ? 細胞內基因重組技術的缺點是，現在只在同種或有近緣關系的微生物之間進行并較難成功。 代謝工程 在闡明代謝途徑及其調控規律的基礎上，應用重組 DNA技術可以改變代謝途徑分支點上的流量或引入新的代謝步驟與構建新的代謝網絡。 其主要步驟為 : ? 鑒定目標代謝途徑涉及的酶 (特別是限速酶 )。 ? 取得酶基因，必要時可用蛋白質工程技術，如定點誘變，基因剪接等，使蛋白具有新的特點 (增強活性或穩定性、解除反饋抑制等 )。 ? 將一種或多種異源的或改造后的酶基因與調節元件一起克隆進目標生物 。 ? 使調節元件的作用及培育條件最優化。 基因工程菌 通過基因工程技術，構建理想的工程菌株 受體系統及克隆表達的研究 受體的獲得 ? 目前使用的氨基酸工程菌受體主要是大腸桿菌 K12及棒狀桿菌家族，通常是通過誘變選育出的基礎產率較高的菌株。 ? 大腸桿菌遺傳背景研究得清楚，載體系統完善，利于工程菌的構建，但它含有內毒素且不能將蛋白產物分泌至胞外，為應用帶來困難。 ? 棒狀桿菌能克服這兩個缺點，但載體受體系統研究較晚且有限制修飾系統的障礙，所以獲得利于外源基因導入及表達且能穩定遺傳的受體菌是尚待解決的問題。 載體的構建 ? 有效的載體需要有在受體菌中可啟動的復制起始位點，這可從棒狀桿菌家族內源小質粒中獲得 。 ? 載體所需的篩選標記及外源基因插入的多克隆位點，可從常用的克隆載體中獲得。 基因轉移手段 ? 通常采用的方法有 :原生質體轉化、轉導，電轉化，接合轉移。 ? 原生質體轉化的方法是較早采用的方法，由于受到原生質體再生條件的局限，效率不高 。 ? 電轉化方法由于高效，快速被廣泛使用，目前它的轉化效率可達到原生質體轉化法的 1001000倍。 ? 接合轉移可用于基因在親緣關系遠的物種之間的轉移，并且可將外源基因整合于染色體上，易于穩定遺傳。 第三節 氨基酸發酵的代謝控制 ? 控制發酵的條件 ? 控制細胞滲透性 ? 控制旁路代謝 ? 降低反饋作用物的濃度 ? 消除終產物的反饋抑制與阻遏作用 ? 促進 ATP的積累，以利氨基酸的生物合成 一、菌種的代謝調控 是氨基酸代謝控制發酵的基本策略之二 控制發酵環境條件 – 專性需氧菌，控制環境條件可改變代謝途徑和產物。 控制細胞滲透性 ?生物素、油酸和表面活性劑，引起細胞膜的脂肪酸成分的改變。 ?細胞內生物素水平高， Glu不能通過細胞膜 ?青霉素：抑制細胞壁的合成，由于細胞面內外的滲透壓而泄露出來。 ?表面活性劑增加細胞膜通透性 ?氨基酸發酵必須考慮的重要因素 細胞透性的調節 細胞透性的調節，一般通過向培養基中添加化學成分（如生物素、油酸、甘油、表面活性劑、青霉素等，達到抑制磷脂、細胞膜的形成或阻礙細胞壁的正常生物合成，使谷氨酸生產菌處于異常生理狀態，解除細胞對谷氨酸向胞外漏出的滲透障礙。 ? 生物素：影響磷脂的合成及細胞膜的完整性。 ? 油酸：直接影響磷脂的合成及細胞膜 ? 甘油：甘油缺陷型菌株喪失 α 磷酸甘油脫氫酶，不能合成α 磷酸甘油和磷脂。 限量供應， 控制了細胞膜中與滲透性直接關系的磷脂含量，使谷氨酸排出胞外而積累。 ? 表面活性劑：對生物素有拮抗作用，拮抗不飽和脂肪酸的合成，導致磷脂合成不足，影響細胞膜的完整性，提供細胞膜對谷氨酸的滲透性。 ? 青霉素：抑制細菌細胞壁的后期合成，形成不完整的細胞壁，使細胞膜失去保護，使胞內外的滲透壓差導致細胞膜的物理損傷，增大谷氨酸向胞外漏出的滲透性、 生物素 阻斷脂肪酸的合成 影響細胞膜的合成 表面活性劑 對生物素有拮抗 阻斷脂肪酸的合成 影響細胞膜的合成 在對數生長期添加青霉素 抑制細胞壁合成 細胞膜損傷 甘油缺陷型 磷脂的合成受阻 影響細胞膜的合成 油酸缺陷型 阻斷不飽和脂肪酸的合成 影響細胞膜的合成 提高細胞膜的 谷氨酸通透性 控制磷脂的合成 使細胞膜受損（如表面活性劑） 青霉素損傷細胞壁，間接影響細胞膜 控制磷脂含量 通過油酸的合成 通過甘油合成 直接控制磷脂合成 控制旁路代謝 降低反饋作用物的濃度 ? 利用營養缺陷型突變株進行氨基酸發酵必須限制所要求的氨基酸的量。 限制瓜氨酸的濃度可解除反饋抑制，實現鳥氨酸的生物合成。 消除終產物的反饋抑制與阻遏作用 – 使用抗氨基酸結構類似物突變株的方法或者通過選育營養缺陷型菌株。 促進 ATP的積累，以利氨基酸的生物合成 ? ATP的積累可促進氨基酸的生物合成 第四節、谷氨酸生物合成及其發酵生產調控 HOOC C H 2 C H 2 C H C OOHNH 2 代謝控制發酵 是用遺傳學或其他生物化學的方法 ， 人為 地在分子水平上改變和控制微生物的代謝 ， 打破微 生物正常的代謝調節 ， 使有用產物大量生成和積累 。 氨基酸發酵是典型的代謝控制發酵 ， 發酵技術的關鍵是 打破微生物的正常代謝調節 ， 人為控制微生物的代謝 。 一 . 谷氨酸的生物合成途徑 異檸檬酸 裂解酶 α酮戊二酸脫氫酶 谷氨酸生物合成中的幾個途徑（正常途徑） （ 1）糖酵解途徑 （ EMP） （ 2）磷酸已糖途徑 （ HMP) （ 3）三羧酸循環 (TCA環 ) （ 4）乙醛酸循環 （ DCA環） （ 5）二氧化碳固定反應 PEP+CO2+GTP 草酰乙酸 +GDP 丙酮酸 +CO2+NADH 蘋果酸 +NAD 草酰乙酸