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蛋白質化學ppt課件(2)-wenkub

2023-05-19 12:08:17 本頁面

　

【正文】化的一般原則分離純化蛋白質的程序 ? 1）前處理（細胞或組織處理） ? 2）粗分級分離（除去雜蛋白） ? 3）細分級分離 ? 4）結晶機械破碎溶劑抽提離心鹽析、等電點沉淀等粗制品 ? ①前處理 ? 以適當方式將組織細胞破碎，使蛋白質以溶解狀態釋放出來，并保持其天然構象和原有生物活性。蛋白質的研究方法 —— 蛋白質的分離、定性定量以及測序 ? 每種細胞都含有成千上萬種丌同的蛋白質。 ? 動物組織：組織搗碎機、勻漿器和超聲波破碎法； ? 植物組織：研磨或用纖維素酶處理； ? 微生物細胞：超聲波法、高壓擠壓或溶菌酶處理。差速離心法的步驟： ? ②粗分級 ? 通常用鹽析、等電點沉淀、超濾、有機溶劑分級等簡便、處理量大的方法從蛋白質混合液中除去大量雜質，得到濃縮蛋白質溶液。 ? ：又稱：離心沉降法 —— 最常用的蛋白質分離方法。利用物質密度的不同，經超速離心后，分布于不同的液層而分離。凝膠顆粒的內部是多孔的網狀結構。凝膠過濾的原理凝膠過濾的步驟（二）根據溶解度差別的分離方法 ? 等電點沉淀法： ? 蛋白質分子在等電點時，凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。原因是蛋白質分子吸附鹽類離子后，而與水分子相互作用加強；當離子強度增大到足夠高時，此時將奪取與蛋白質的水化層，且鹽中和了蛋白表面的電荷，使蛋白質凝聚沉淀。 ? 為了防止蛋白質在分離過程中發生變性，有機溶劑濃度不能太高，而且需要在低溫條件下進行。 (三 ) 根據電性質不同的分離方法 ? 區帶電泳：將蛋白質溶液點在浸了緩沖液的支持物上迚行電泳，丌同組分形成帶狀區域。因此， Eq值接近一個常數。基本原理和特點 1）還原劑處理后，二硫鍵斷裂；非共價相互作用破壞，亞基分離； 2）經 SDS處理后帶大量負電荷，掩蓋了原來的電荷差異。 ? 等電聚焦電泳：外加電場時，蛋白質混合物在具有pH梯度的介質中移動，當蛋白質在其等電點時，凈電荷為零，在電場中丌再移動。 ? 層析技術有 ?凝膠層析 ?離子交換層析 ?吸附層析 ?親和層析 (四 ) 根據吸附性質不同的分離方法吸附層析法（吸附色譜法）：某些物質對不同種類的蛋白質具不同程度的吸附能力。 (五 ) 根據配體特異性的分離 —— 親和層析 ?親和色譜法（ Affinity chromatography） —是一種高效分離純化蛋白質的方法 ? 在固定相載體表面偶聯具有特殊親和作用的配基，這些配基可以與流動相中溶質分子發生可逆的特異性結合而進行分離的一種方法，稱之為親和層析。當含有待純化的蛋白質溶液通過色譜柱時，該蛋白質即與配基發生特異性結合而被吸附在色譜柱上，而其它蛋白質則流出柱外。親和層析法的步驟總結：蛋白質的分離純化的方法 ? 透析、超濾 ?根據性質：分子大小 ? 鹽析（ salting out） ?根據性質：蛋白質的沉淀 ?作用機理：中性鹽中和表面電荷，破壞水化層 ?影響因素：表面電荷、水化層、溶劑性質 ? 超速離心：分子大小及形狀、溶液特性 ? 電泳： ? 根據性質：蛋白質的兩性解離 ? 作用機理：異性電荷互相吸引 ? 影響因素：電荷種類及數量、分子大小及形狀、溶液離子強度及 pH等 ? 層析 ? （ 1）分子篩（凝膠過濾層析）：分子大小及形狀 ? （ 2）離子交換層析：電荷、分子量、分子形狀 ? （ 3）吸附層析：吸附特性 ? （ 4）親和層析：生物特性三、蛋白質的分析測定酚試劑法凝膠電泳 N末端分析等含量測定純度鑒定

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