基因表達(dá)及功能分析基本策略-預(yù)覽頁(yè)

　

【正文】 酶聯(lián)免疫吸附分析（ Enzymelinked immunosorbent assay， ELISA） 也是一種建立在抗原 抗體反應(yīng)基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)分析基本方法。 被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)、腫瘤學(xué)和免疫學(xué)等領(lǐng)域。（ immunofluorescence），可應(yīng)用熒光（倒置）顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡（ confocal microscopy） 對(duì)靶分子進(jìn)行定性、定量和定位分析，激光共聚焦顯微鏡還可進(jìn)行斷層成像，是在蛋白質(zhì)水平分析基因表達(dá)的直觀方法。運(yùn)用雙重著色或多重著色程序同時(shí)對(duì)多個(gè)感興趣的靶分子進(jìn)行檢測(cè)，是一種揭示更多有關(guān)細(xì)胞群的功能和它們之間相互作用信息的有效方法。（四）流式細(xì)胞術(shù)用于分析 表達(dá)特異蛋白質(zhì)的陽(yáng)性細(xì)胞目 錄216。216。 高通量檢測(cè)技術(shù)適合 “組學(xué) ”（ omics）研究，更適合生命活動(dòng)過(guò)程相關(guān)的基因表達(dá)譜分析。目 錄 216。測(cè)序方法能輕易地解決芯片技術(shù)在檢測(cè)小分子時(shí)遇到的技術(shù)難題 (短序列 , 高度同源 ), 而且小分子 RNA的短序列正好配合了高通量測(cè)序的長(zhǎng)度 ,同時(shí)測(cè)序方法還能在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新的小分子 RNA。 是將具有高度親和特異性的探針?lè)肿樱ㄈ鐔慰寺】贵w）固定在基片上，用以識(shí)別復(fù)雜生物樣品溶液中的目標(biāo)多肽；蛋白質(zhì)功能芯片可用來(lái)研究蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì) /DNA蛋白質(zhì) /RNA蛋白質(zhì)，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與藥物、酶與底物、小分子 蛋白質(zhì)等的相互作用。電泳結(jié)果經(jīng)染色后，即可對(duì)不同樣品中蛋白質(zhì)的表達(dá)譜進(jìn)行比較；還可從凝膠中將特定的蛋白質(zhì)點(diǎn)切下，經(jīng)胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用 質(zhì)譜（ mass spectrum）技術(shù)進(jìn)行定性分析，對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。 BLAST是一個(gè)序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序家族，其中包括許多有特定用途的程序。 目前已經(jīng)有很多種聚類的方法應(yīng)用到基因芯片的研究當(dāng)中，如層次聚類 (Hierarchical clustering)、 K 均值聚類 (Kmeans clustering)、自組織映射 (self anizing map)、 PCA (principlepo analysis)等。首先收集現(xiàn)有的蛋白質(zhì)家族，構(gòu)造模體數(shù)據(jù)庫(kù)；216。目 錄基因 組 功能注 釋 常用數(shù)據(jù) 庫(kù)目 錄 現(xiàn)在人們已經(jīng)越來(lái)越清楚地認(rèn)識(shí)到，生物功能大多不是只由一個(gè)或幾個(gè)基因控制的，而是通過(guò)生物體內(nèi)眾多的分子（如 DNA、 RNA、蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)）共同構(gòu)成的復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)的。二、利用生物網(wǎng)絡(luò)全面系統(tǒng)地了解基因的功能 目 錄 生物體任何細(xì)胞的遺傳信息、基因都是相同的，但同一個(gè)基因在不同組織、不同細(xì)胞中的表達(dá)卻不相同。由于細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)通路之間存在著緊密的聯(lián)系和交叉調(diào)控 , 形成了非常復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。 （二）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)目 錄常用信號(hào)通路數(shù)據(jù) 庫(kù)目 錄 代謝網(wǎng)絡(luò)處于生物體的功能執(zhí)行階段，其結(jié)構(gòu)組成方式反映了生物體的功能構(gòu)成。闡明蛋白質(zhì)相互作用的完整網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有助于從系統(tǒng)的角度加深對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識(shí)。目 錄① 疾病的基因組合及相互作用信息的提取：即對(duì)復(fù)雜疾病相關(guān)靶基因的識(shí)別，以及利用 SNPs、基因、蛋白質(zhì)等不同類型的信息，構(gòu)建疾病驅(qū)使相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)。目前在已知的 ～ 3萬(wàn)個(gè)人類基因中，大約 70%的基因我們還不清楚它們的功能，有 90%的基因我們不知道它們?cè)隗w內(nèi)的確切生理作用，因此，利用各種技術(shù)手段研究基因組中功能未知基因的作用，將是 “后基因組時(shí)代 ”功能基因組學(xué)研究的主要內(nèi)容。通常采用基因功能獲得和 /或基因功能缺失的策略，觀察基因在細(xì)胞或生物個(gè)體中的，細(xì)胞生物學(xué)行為或個(gè)體表型遺傳性狀的變化，來(lái)鑒定基因的功能。常用的方法有轉(zhuǎn)基因和基因敲入技術(shù)等。1. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可在整體水平研究基因的功能目 錄轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作原理示意圖目 錄優(yōu)點(diǎn)：1. 利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型研究外源基因，能夠接近真實(shí)地再現(xiàn)基因表達(dá)所導(dǎo)致的結(jié)果，及其在整體水平的調(diào)控規(guī)律，把復(fù)雜的系統(tǒng)簡(jiǎn)單化，具有系統(tǒng)性和獨(dú)立性，是目前層次最高的實(shí)驗(yàn)體系。目 錄目前，科學(xué)家已經(jīng)采取了多種方法使轉(zhuǎn)基因技術(shù)更加完善： 為了更為精確地調(diào)控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，使其獲得時(shí)空特異性的調(diào)控，在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體時(shí)， 選擇只在特定的細(xì)胞類型或特定的生命時(shí)期才啟動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子 ，即可使外源基因獲得時(shí)空特異性的表達(dá)。216。目 錄216。216。目 錄 基因打靶的原理示意圖 目 錄 基因功能研究的功能失活策略是通過(guò)觀察，細(xì)胞或個(gè)體的某一基因功能被部分或全部失活后，細(xì)胞生物學(xué)行為或個(gè)體遺傳性狀表型的變化，來(lái)鑒定基因的功能。 （一）基因敲除可以使基因的功能完全缺失目 錄基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制： 有些重要的靶基因被敲除后會(huì)引起胚胎早期死亡，使得無(wú)法分析該基因在胚胎發(fā)育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的細(xì)胞類型中執(zhí)行不同的功能，完全敲除會(huì)導(dǎo)致突變小鼠出現(xiàn)復(fù)雜的表型，使研究者很難判斷異常的表型是由一種細(xì)胞引起的，還是由幾種細(xì)胞共同引起的。目前最常用的基因沉默技術(shù)包括：（ RNA interference， RNAi）（ antisense oligonucleotide， ASON）（二）基因沉默可以使基因的功能部分缺失目 錄 RNAi是指雙鏈 RNA介導(dǎo)同源序列的 mRNA特異性降解，導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。目 錄 RNAi的作用機(jī)制示意圖目 錄目前有 5種方法可用于制備 siRNA：1. 化學(xué)合成法2. 體外轉(zhuǎn)錄法3. 長(zhǎng)鏈 dsRNA的 RNaseⅢ 體外消化法4. siRNA表達(dá)載體法5. siRNA表達(dá)框架法 前 3種方法是在體外制備然后導(dǎo)入到細(xì)胞中；后兩種則是基于具有合適啟動(dòng)子的載體或轉(zhuǎn)錄元件，在哺乳動(dòng)物或細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄生成。 已被作為一種簡(jiǎn)便和有效的工具廣泛用于基因功能的研究。 2. 反義寡核苷酸也可引發(fā)基因沉默 由于反義寡核苷酸技術(shù)簡(jiǎn)便易行，已成為研究基因功能的方法之一。 隨機(jī)突變篩選策略的第一步是通過(guò)物理誘變、化學(xué)誘變或生物技術(shù)產(chǎn)生大量的基因組 DNA突變。ENU誘變主要誘發(fā)單堿基突變 , 造成單個(gè)基因發(fā)生突變 (雙突變的情況非常少 ), 更接近于人類遺傳性疾病的基因突變情況。由于 ENU處理后雄鼠精子基因組發(fā)生點(diǎn)突變，使得后代小鼠有可能出現(xiàn)突變表型，經(jīng)篩選及遺傳試驗(yàn)即可得到突變系小鼠。利用基因捕獲可以建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的 ES細(xì)胞庫(kù) , 每一種 ES細(xì)胞克隆中含有不同的突變基因， ES細(xì)胞克隆經(jīng)囊胚注射發(fā)育為基因突變動(dòng)物模型，通過(guò)對(duì)動(dòng)物模型的表型分析鑒定突變基因的功能。隨機(jī)突變篩選策略能夠獲得功能基因研究的新材料及人類遺傳性疾病的新模型 , 這種 “表型驅(qū)動(dòng) ”的研究方式有可能成為功能基因組研究最有前景的手段和捷徑。 基因功能的鑒定最終仍需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證 ，尤其是在生物體內(nèi)從整體水平對(duì)基因功能進(jìn)行研究，是鑒定基因功能的最終解決方案。 三月 21三月 21Wednesday, March 24, 2023雨中黃葉樹，燈下白頭人。 三月 21三月 2110:57:1310:57:13March 24, 20231他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國(guó)見青山。 10:57:13 上午 10:57 上午 10:57:13三月 21沒(méi)有失敗，只有暫時(shí)停止成功！。 10:57:1310:57:1310:57Wednesday, March 24, 20231不知香積寺，數(shù)里入云峰。 2023/3/24 10:57:1310:57:1324 March 20231空山新雨后，天氣晚來(lái)秋。 三月 2110:57:1310:57Mar2124Mar211越是無(wú)能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)兒。 24 三月 202310:57:13 上午 10:57:13三月 211最具挑戰(zhàn)性的挑戰(zhàn)莫過(guò)于