基因表達及功能分析基本策略(更新版)

　　

【正文】 21楊柳散和風，青山澹吾慮。 三月 21三月 21Wednesday, March 24, 2023很多事情努力了未必有結果，但是不努力卻什么改變也沒有。 10:57:1310:57:1310:573/24/2023 10:57:13 AM1以我獨沈久，愧君相見頻。目 錄 分析基因表達可以從 RNA和蛋白質水平上進行。通過對突變小鼠的深入研究、對突變基因定位及位置候選法克隆突變堿基就會得到突變基因的功能信息。目 錄 ENU誘變 是近年來發展起來的研究基因功能的新手段。目 錄缺點：1. 該技術可能對靶基因的相似序列發生作用，導致脫靶（ offtargeting）效應。 RNAi是機體的一種天然防御機制，具有防御病毒感染、入侵等功能。常用的方法主要有基因敲除基因沉默二、采用功能失活策略鑒定基因的功能目 錄 基因敲除（ gene knockout） 屬于基因打靶技術的一種，其操作步驟和原理與基因打靶技術相同。基因敲入是基因打靶技術的一種，基因打靶技術是20世紀 80年代后半期發展起來的，一種按預期方式準確改造生物遺傳信息的實驗手段。可調控的基因表達系統也是一種常用的方法： 例如四環素調控系統，該表達系統可使轉基因動物體內外源基因的表達受誘導劑（四環素）的調控，通過加入或去除誘導劑，就可以實現對外源基因表達時間及水平的控制。一、采用功能獲得策略鑒定基因的功能目 錄 轉基因技術（ transgenic technology） 是指將外源基因導入受精卵或胚胎干細胞中，通過隨機重組使外源基因插入細胞染色體 DNA，再將受精卵或胚胎干細胞植入受體動物的子宮，使得外源基因能夠隨細胞分裂遺傳給后代。216。 近年來各種預測蛋白質相互作用的計算方法被不斷提出，將這些方法與實驗方法結合，挖掘出了蛋白質相互作用網絡中更多的相互作用節點，目前已有多個蛋白質相互作用的數據庫應運而生，可用來研究蛋白質相互作用的生物學過程 。信號轉導網絡研究的目的是期望通過建立細胞信號傳導過程的模型，找出參與此過程的各個蛋白質間的相互作用關系，闡明其在基因調控、疾病發生中的作用。當前生物學面臨的巨大挑戰之一就是，了解生物體內復雜的相互作用網絡以及它們的動態特征。目 錄 在氨基酸序列整體同源性不明顯的情況下，對蛋白質的功能域進行分析將對預測基因功能提供極其有價值的信息。 可同時分離數成百上千的蛋白質。目 錄基因芯片的缺點 : 在于它是一個 “封閉系統 ”, 它只能檢測人們已知序列的特征 (或有限的變異 )。目 錄1. 基因芯片已成為基因表達譜分析的常用方法 基因芯片（ gene chip）又稱 DNA微陣列 (DNA microarray)、 DNA芯片（ DNA chip） , 是將大量已知序列的核酸片段（包括寡核苷酸、 cDNA、基因組 DNA、 microRNA等 ) 集成在同一基片上，組成密集分子排列，通過與標記樣品進行雜交，檢測、獲取細胞或組織的基因信息。流式細胞術可以檢測活細胞，也可以檢測用甲醛固定的細胞。216。 該方法不需經電泳分離待檢樣品蛋白質，而是預先將樣品包被在支持體上，以后反應過程與 Western 印跡大致相同 ——順序結合（即 “吸附 ”）特異抗體（一抗）及與酶連接的第二抗體（也可預先包被抗體， “吸附 ”抗原），再進行酶 底物反應。 該方法適合對待測樣品進行初步篩選，目前已廣泛被實時定量 PCR替代。216。可用于 mRNA定量和 RNA剪接分析 216。開放性系統研究方法 : 如差異顯示 PCR、雙向基因表達指紋圖譜、分子索引法、隨機引物 PCR指紋分析等，可以發現和分析未知的基因。可對 mRNA進行區域定位 216。 可用于 mRNA的半定量分析 216。實時定量 PCR (Realtime Quantitative Polymerase chain Reaction,RQPCR)是定量分析 mRNA的最通用、最快速、最簡便的方法，該方法是對 PCR反應進行實時監測，具有很高的靈敏度和特異性。 被廣泛應用于微生物學、寄生蟲學、腫瘤學和免疫學等領域。運用雙重著色或多重著色程序同時對多個感興趣的靶分子進行檢測，是一種揭示更多有關細胞群的功能和它們之間相互作用信息的有效方法。216。目 錄 216。 是將具有高度親和特異性的探針分子（如單克隆抗體）固定在基片上，用以識別復雜生物樣品溶液中的目標多肽；蛋白質功能芯片可用來研究蛋白質修飾、蛋白質 蛋白質 /DNA蛋白質 /RNA蛋白質，以及蛋白質與脂質、蛋白質與藥物、酶與底物、小分子 蛋白質等的相互作用。 BLAST是一個序列數據庫搜索程序家族，其中包括許多有特定用途的程序。首先收集現有的蛋白質家族，構造模體數據庫；216。二、利用生物網絡全面系統地了解基因的功能 目 錄 生物體任何細胞的遺傳信息、基因都是相同的，但同一個基因在不同組織、不同細胞中的表達卻不相同。 （二）利用生物網絡研究信號轉導目 錄常用信號通路數據 庫目 錄 代謝網絡處于生物體的功能執行階段，其結構組成方式反映了生物體的功能構成。目 錄① 疾病的基因組合及相互作用信息的提取：即對復雜疾病相關靶基因的識別，以及利用 SNPs、基因、蛋白質等不同類型的信息，構建疾病驅使相關基因網絡。通常采用基因功能獲得和 /或基因功能缺失的策略，觀察基因在細胞或生物個體中的，細胞生物學行為或個體表型遺傳性狀的變化，來鑒定基因的功能。1. 轉基因動物可在整體水平研究基因的功能目 錄轉基因動物制作原理示意圖目 錄優點：1. 利用轉基因動物模型研究外源基因，能夠接近真實地再現基因表達所導致的結果，及其在整體水平的調控規律，把復雜的系統簡單化，具有系統性和獨立性，是目前層次最高的實驗體系。216。216。 （一）基因敲除可以使基因的功能完全缺失目 錄基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制： 有些重要的靶基因被敲除后會引起胚胎早期死亡，使得無法分析該基因在胚胎發育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的細胞類型中執行不同的功能，完全敲除會導致突變小鼠出現復雜的表型，使研究者很難判斷異常的表型是由一種細胞引起的，還是由幾種細胞共同引起的。目 錄 RNAi的作用機制示意圖目 錄目前有 5種方法可用于制備 siRNA：1. 化學合成法2. 體外轉錄法3. 長鏈 dsRNA的 RNaseⅢ 體外消化法4. siRNA表達載體法5. siRNA表達框架法 前 3種方法是在體外制備然后導入到細胞中；后兩種則是基于具有合適啟動子的載體或轉錄元件，在哺乳動物或細胞中轉錄生成。 2. 反義寡核苷酸也可引發基因沉默 由于反義寡核苷酸技術簡便易行，已成為研究基因功能的方法之一。ENU誘變主要誘發單堿基突變 , 造成單個基因發生突變 (雙突變的情況非常少 ), 更接近于人類遺傳性疾病的基因突變情況。利用基因捕獲可以建立一個攜帶隨機插入突變的 ES細胞庫 , 每一種 ES細胞克隆中含有不同的突變基因， ES細胞克隆經囊胚注射發育為基因突變動物模型，通過對動物模型的表型分析鑒定突變基因的功能。 基因功能的鑒定最終仍需要通過實驗來驗證 ，尤其是在生物體內從整體水平對基因功能進行研究，是鑒定基因功能的最終解決方案。 三月 21三月 2110:57:1310:57:13March 24, 20231他鄉生白發，舊國見青山。 10:57:1310:57:1310:57Wednesday, March 24, 20231不知香積寺，數里入云峰。 三月 2110:57:1310:57Mar2124Mar211越是無能的人，越喜歡挑剔別