降解酒糟生物質的纖維素分解細菌的篩選及產酶研究_大學本科畢業論文-免費閱讀

　　

【正文】 此時，誰也不會想到，最后我們會在這里留下那么多遺憾，此時的我們只會想到成功會屬于我們，也只可以屬于我們，因為我們有最好的導師 。 又由于纖維素酶是一種誘導型復合酶系，單一菌株降解纖維素的能力有限，需要多菌種協同才有可能最大化地降解纖維素，所以本試驗所獲菌株單獨降解纖維素能力可 能有所不足。 因纖維素空間結構和纖維素酶酶系組成對纖維素分解效果影響顯著。 從試驗中可以看出， 單菌株濾紙條崩解實驗證明單株細菌對濾紙條纖維素的分解能力比較弱， 通過 查閱有關文獻，知道有通過多菌種混合培養，利用不同菌種分泌的多種酶之間的協同作用，得到對濾紙條纖維素具有較強分解能力的菌 貴 貴州大學本科畢業論文（設計） 第 18 頁 株組合。C 培養條件下，前期，高溫培養的細菌生長快于低溫培養，但 3d 之后，二者趨向平衡；后期， 30 176。在這 103株菌中，最具研究價值的有近 20株，本試驗著重選取了其中 13株，分別是 50 176。 貴 貴州大學本科畢業論文（設計） 第 15 頁 圖 葡萄糖 DNS 顯色反應 濾紙條崩解實驗 表 濾紙崩解試驗情況 菌株編號 培養液沉淀 情況 顆粒物分布 狀況 菌落顏色 培養液液面有無菌落層 濾紙崩解狀 況 培養液渾濁 度 BH19 無 稀薄 極低 BH314 絮狀 均勻 少量 + 低 BH331 無 少量 極低 BH520 微量 下層較多 大量 極低 BH526 無 均勻 少量 極低 BH536 無 少量 極低 BH634 少量 稀薄 極低 BL345 中量 上層較多 黃色 無 + 低 BL465 少量 上層較多 灰色 少量 極低 BL5581 大量 上層較多 黃紅色 無 ++ 中度 BL595 中量 均勻 紅白交替 無 ++ 中度 BL599 中量 均勻 無 ++ 中度 BL5106 微量 均勻 無 +++ 高度 貴 貴州大學本科畢業論文（設計） 第 16 頁 上表 單菌株純培養崩解濾紙條試驗結果，除了 2株細菌 BL5106一具有一定降解濾紙條的能力外，其他單菌株在連續 8d的恒溫振蕩培養過程中不能使濾紙條崩解，這也可能是培養時間不夠長，或是濾紙成分構成的原因。 纖維素分解細菌的復篩 結果 對具有纖維素分解功能的菌株分別進行搖瓶培養，測定酶活力，其中菌株BL5106產纖維素酶活力最高，其酶活為 U/mL。 通過肉眼的觀察判斷， 50176。C 條件下，待到用時再取出，但要注意保存時間不宜過長，通常為 7 d。C 3d BL345 30176。 表 明圈與菌落半徑比值及其他數據統計情況。其中，菌落半徑最大的為 cm， BL595 透明圈與菌落半徑比值最大的，達到 15。在 560 nm 波長處測 吸光度 并做好記錄。每次測酶活時均設一個總的空白樣，即在試管中不加底物和酶液，只加蒸餾水 mL，用作測量 吸光度 時的參比。 3．濾紙崩解 的測定 分別用接種環取一環 初篩得到的菌種，將其接種到 裝有 10 mL濾紙培養液 的10mL試管 中， 置于 30176。 根據 DNS (3， 5二硝基水楊酸 )比色法測定原理繪制葡萄糖標準曲線 [16]。 然后以時間為橫坐標，以 OD值 為縱坐標，繪制菌體生長曲線。C 下 倒置 培養 2 d，每天檢測觀察各菌株的菌落狀況，最后通過滴加革蘭氏碘液， 靜置 10 min，傾去染液，將平板置于白色背景下，觀察透明圈產生的清晰度， 測量菌落及淺色透明圈半徑（ R， mm），并拍照記錄 。 主要儀器 儀器名稱 型號 生產廠商 冰箱 BCD215KALM 青島海爾股份有限公司 電熱恒溫培養箱 DH6000BH 天津市泰斯特儀器有限公司 電子天平 ALB224 賽多利斯科學儀器有限公司 單人單面凈化工作臺 SW— CJ— 1FD 蘇州凈化設備有限公司 恒溫振蕩器 ZD— 85A 常州澳華儀器有限公司 型電熱鼓風干燥箱 101— 2AB 天津市泰斯特儀器有限公司 型電熱恒溫鼓風干燥箱 DHG— 9240 上海一恒科技有限公司 紫外可見分光光度計 721GG 上海儀電分析儀器有限公司 高速臺式離心機 TGL— 16B 上海安亭科學儀器廠 貴 貴州大學本科畢業論文（設計） 第 7 頁 方法 分離、純化 將從貴州茅臺酒廠取樣到的樣品搗碎后，取適量濾液接 取 g樣品于 mL無菌水中制備成 1%的菌懸液，震蕩培養 30 min用無菌蒸餾水稀釋 10 1010 105四個梯度，然后再用無菌吸管吸取 100 μL菌懸液滴入牛肉膏蛋白胨培養基上涂布均勻，分別在 30 176。量取 0. 1 mo l/ L檸檬酸溶液 57 mL， 0. 1 mol / L 檸檬酸三鈉溶液 mL，再量取 mL蒸餾水 混勻，配成 pH4. 0. 05 mol / L 的檸檬酸緩沖液。7H2O g、 CaCl2 g、 K2HPO47H2O g、 NaNO3 g、 KCl g、瓊脂 g、蒸餾水 ，調 pH 。 表 樣品基本理化性質 樣品名稱 含水率 有機 C 有機質 pH 全 K 速效 K 全 P 全 N 堿解 N % g/kg g/kg mg/kg mg/kg % g/kg mg/km 茅臺酒糟 301 車間酒糟 茅臺大曲 茅臺酒醅 1 茅臺有機高粱基地土壤 廢舊稻草 小麥粉 里村組土壤 里列組土壤 貴 貴州大學本科畢業論文（設計） 第 4 頁 研究內容和技術路線 主要研究內容 1．試驗在 30176。 平均海拔高度 880 m，年平均氣溫 176。C 。根據細菌的生理學特性，一般將纖維素降解細菌分類為：厭氧型、好氧型和好氧滑動菌。 對纖維素酶產生菌的研究過去多集中于真菌的研究和應用，鑒于細菌繁殖和產酶速度快、發酵周期短，有利于工業生產，故近年來對細菌產纖維素酶日益引起重視。C和 30℃培養篩選條件下 選取 7株 和 6株，對 這些菌株 進行 纖維素酶活及其他 各項指標的測定。 本科畢業論文（設計） 論文（設計）題目：降解酒糟生物質的纖維素分解細菌的篩選及產酶研究 學 院： 農 學 院 ＿ 專 業： 農業資源與環境 班 級： ＿ 09 農 資＿ ＿ 學 號： ＿ 0909010165 ＿ 學生姓名： ＿ ＿ ＿＿ 指導教師： ＿ ＿ 20xx 年 5 月 28 日 貴州大學本科畢業論文（設計） 誠信責任書 本人鄭重聲明：本人所呈交的畢業 論文（設計） ，是在導師的指導下獨立進行研究所完成。 菌株的生長曲線試驗分別在 30℃（中溫）條件下靜置培養和 50℃（高溫）條件下振蕩進行培養。纖維素酶的比活力一般都很低，因而產酶成本高。好氧細菌以可溶性胞外酶的形式分泌出 3種纖維素酶對纖維素進行水解， 如纖維桿菌屬 (Culmolnoas)的纖維單胞菌。對酒糟發酵減重最高達 18%。C ，年日照時數 1400 h，無霜期 311 d，年降雨量800— 1000 mL。C 及 50176。 3． LB 培養基 [14]： 蛋白胨 g、 NaCl g、酵母膏 g、蒸餾水 ml、調 pH 。3H2O g、 KH2PO4 g、 NH4NO3 g、 FeCl3 3．醋酸緩沖液 (pH )：取 g 冰醋酸鈉溶于 mL 蒸餾水中，用冰醋酸將該溶液的 pH 值調至 （ 約用 l2 mL） ，用蒸餾水定容至 mL。C 及 50176。根據透明水解圈半徑和菌落半徑的比值大小初步判斷菌株產纖維素酶的能力，選取比值大的菌株繼續進行研究。 貴 貴州大學本科畢業論文（設計） 第 8 頁 纖維素分解細菌的復篩 1．葡萄糖標準曲線的繪制 取 7支 10 mL試管，編號，按表 （ 500 mg/L）溶液與蒸餾水混勻，既得各種不同濃度的標準葡萄糖液。 2． 粗酶液制備 將初篩選取的菌株環取一環接種到纖維素羧甲基鈉活化培養液中， 30176。C 、 50176。對每個樣品都設一個參照樣，先加 mL 蒸餾水，后加 mL 相應樣品的粗酶液。定義每分鐘催化纖維素水解生成 1 μg葡萄糖的酶量為一個酶活單位， 即 在 50176。透明圈與菌落半徑比值超過 10 的有 12 株，透明圈與菌落半徑比值超過 5 的有 103 株。 表 初篩中 13株細菌 透明圈與菌落半徑比值 樣品編號 菌落半徑（ cm） 透明圈半徑 （ cm） 透明圈與菌落半徑比值 培養溫度 培養時間 BH19 50176。C 3d BL465 30176。 做長期保存則是 將菌種接種到斜邊保存基上， 4176。C 、 120 r /min 振蕩培養 下的菌種，其吸光度因顆粒分布不均，必然無法準確測定。 將分離到的 13 株菌分別接種一環到裝有 mL 液體培養基的三角瓶中， 30 176。 結合生長曲線測定的 OD可以推斷，液體渾濁度高的相對的 OD就大，對濾紙的分解能力相應也會較強。C條件篩選的 7株和 30 176。C 條件下篩選的部分菌株（ BL5106）性能優于 50 176。這說明纖維素的有效分解需要多菌種分泌多種酶的協同參與。經高溫蒸餾的酒糟中纖維素的晶狀結構被部分破壞，有利于纖維素酶的作用。 通過以上試驗，對所篩選的細菌有做了進一步的淘汰，在得到 1株較為高效的纖維素分解菌的同時，也建立了初步的探究模式，這為 下一步的工作創造了便利。 而事實證明 ，沒有足夠的努力，就不會有最好的結果。我們設計思路，制定方案，清洗儀器，準備 器材，同時實驗室也迎來了第一批客人，茅臺酒廠派來的 “ 監工 ” ，我們一起開始了菌種的分離。產纖維素酶酶活和濾紙酶活高的菌株分解酒糟的效率不一定好。更為主要的是這種方法