降解酒糟生物質(zhì)的纖維素分解細(xì)菌的篩選及產(chǎn)酶研究_大學(xué)本科畢業(yè)論文(留存版)

　　

【正文】 III Screening of Vinasse Cellulose Deposing Bacteria and Research on Enzyme Production ABSTRAC T 244 bacteria strains which could form a sharp and distinct zone around the cellulaseproducing microbial colonies on carboxymethylcellulose (CMC) plates with Gram’ s iodine had been isolated. There were 103 strains which the radius ratio of distinct zone and colony was more than , and among which, the radius ratio was more than were 12 strains. Especially, the radius ratio of strain BL595 was the highest (). The strain number which the radius of distinct zone was more than cm under 30℃ and more than cm under 50℃ conditions was 20. In this study, 7 strains from 50℃ conditions and 6 strains from 30℃ conditions had been chosen to assay the active of cellulases and other index. The growth curve of strains test were cultured under 30℃ static culture and 50℃ oscillation conditions, respectively. There were lawns appearing on the culture medium surface, and the liquid were clarification under oscillation conditions. However, there was precipitation in the bottom of the test tube. In contrast, the liquid were overall turbidity under static conditions. Strains cultured under 50℃ oscillation conditions grew faster than the strains from 30℃ conditions during the earlier incubation stage, however, the growth from different conditions were consistency after incubation 3 d. The performance of strain BL516 from 30℃ conditions was better than the strains from 50℃ conditions. The cellulose active of BL5106 was the highest, which was U/mL. This study provides preparation and microbes for the posting experiment. Keywords: cellulose deposing bacteria, enzymatic activity, cellulase activity, screening 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 1 頁(yè) 1 前言 研究意義及目的 酒糟是釀酒業(yè)最主要的副產(chǎn)物， 在 我國(guó) ， 每年白酒酒糟產(chǎn)量都在 2500 萬(wàn) t以上 [1]。 國(guó)內(nèi)外研究概況 在關(guān)于纖維素酶 活性及發(fā)酵時(shí)間、溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響研究方面，江龍法等 [12]從白酒糟采集的樣品中初篩得到產(chǎn)纖維素酶酶活較高的 5 株菌。C 條件下保存。3H2O g、 MgSO4 6．濾紙紙 1 %醋酸浸泡 24 h，用碘液檢驗(yàn)確定無(wú)淀粉后。每 4 h取樣一次通 過(guò)分光光度法測(cè)定菌體濃度 。CMC酶活力的測(cè)定：取 CMC 緩沖液 mL于比色皿中，加入 mL 稀釋 10 倍 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 9 頁(yè) 的酶液， 50176。C 恒溫水浴加熱，充分反應(yīng) 30 min。 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 11 頁(yè) 共選取 13 株菌進(jìn)行纖維素酶活力等測(cè)定 ， 圖 是初篩 時(shí)幾株透明圈較為明顯細(xì)菌。C 3d BL5106 30176。 表 LB 菌懸液 OD 測(cè)定 菌株編號(hào) 0（ h）OD660nm 4（ h）OD660nm 8（ h）OD660nm 12（ h）OD660nm 16（ h）OD660nm 20（ h）OD660nm 24（ h）OD660nm 28（ h）OD660nm 32（ h）OD660nm 36（ h）OD660nm 40（ h）OD660nm BH19 BH314 BH331 BH520 BH526 BH536 BH634 BL345 BL465 BL5581 BL595 BL599 BL5106 注： 生長(zhǎng)曲線的繪制時(shí) 以細(xì)菌懸液的 吸光度 （ ） 為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo) 繪 出 。 下 圖 一組 以 LB去除碳源為培養(yǎng)液，添加濾紙作為唯一碳源，接種一環(huán)連續(xù)培養(yǎng) 5d后，培養(yǎng)液及濾紙的出現(xiàn)的一些直觀情況，以此可作為挑選菌株的參考依據(jù)。C 靜置條件下培養(yǎng)，菌懸液散步較均勻，長(zhǎng)期培養(yǎng)下（ 4d）除 BL599 和 BL5106 外，其余菌液管液面上均有稀薄的一層菌落。 還有纖維素酶酶系組成和纖維素的結(jié)構(gòu)對(duì)分解纖維素的效果有明顯的影響。也許是一開(kāi)始的期待太大，所以會(huì)對(duì)結(jié)果失望吧！ 在本論文完成之際，我要向所有幫助過(guò)我的老師、同學(xué)表示衷心的感謝！ 但我最想 感謝的是我的導(dǎo)師， 您的嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)心，負(fù)責(zé)溫和感染了我，這份影響很珍貴！ 謝謝您！易老師！ 。 在通常情況下，影響酶活力的因素較多，如酶的濃度、底物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)、pH 值、 反應(yīng)溫度等。 在震蕩條件下培養(yǎng)，菌體懸浮液面生長(zhǎng)，并連接成團(tuán)，沒(méi)有均勻散開(kāi)，所以雖然在培養(yǎng)后期（ 2d），以肉眼可見(jiàn)大量聚集成團(tuán)的菌落，但 吸光度 變同時(shí)間沒(méi)有相關(guān)性。 濾紙這種非天然纖維素底物化學(xué)組成均一、試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，是普遍選用的篩菌底物，但用其進(jìn)行的纖維素酶活性檢測(cè)不能真實(shí)地反映菌株對(duì)酒糟這類復(fù)雜組分的纖維素的降解能力。 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 13 頁(yè) 表 中記錄的數(shù)值， 50176。C 3d BL595 30176。C 培養(yǎng)條件下的，選取透明圈半徑超過(guò) 2 cm，透明圈與菌落半徑比值大于 3 的 7 株菌； 30176。C 和 30176。C 則在 120 r /min下振蕩培養(yǎng) 24 h，不同處理做 3個(gè)重復(fù)。C 條件下保存， 以作下一步的研究 [15]。 5．葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶 液的配制：將葡萄糖放在 110 176。 5． 濾紙 崩解 培養(yǎng)基：蛋白胨 g、酵母膏 g、 NaCl g、蒸餾水 mL、調(diào) pH ，每 mL 培養(yǎng)基加入 mL 試管中，再加入濾紙（ 1cm6cm）。茅臺(tái)鎮(zhèn)被數(shù)目龐大的特殊微生物群籠罩其中，正是它們充當(dāng)了釀酒業(yè)的主力軍。纖維小體附著在細(xì)菌細(xì)胞表面，所以細(xì)菌需要粘附在纖維上，使纖維小體在纖維的接觸點(diǎn)處對(duì)纖維素進(jìn)行水解，如熱纖梭菌（ Clostridium thermocellum）。高溫振蕩培養(yǎng)的菌株在培養(yǎng)前期（ 12 h） 生長(zhǎng)快于低溫 靜置 培養(yǎng) 的菌株 ，但 培養(yǎng) 3 d后，二者 生長(zhǎng)趨勢(shì) 趨向 一致，但中溫 條件下篩選的部分菌株（ BL5106）性能優(yōu)于 高溫 條件下篩選得到的菌株。 在這 103株菌中， 產(chǎn)透明圈半徑大于 cm（ 30℃）和 cm（ 50℃）的菌株有 20株 。 酶活較強(qiáng)的菌種有纖維桿菌屬 (Culmolnoas)、生孢纖維菌屬 (sporocytophaga)[7]和梭菌屬 (cellulomonas)。 酒糟的利用研究也有進(jìn)展，歸納起來(lái)，主要是通過(guò)生物法，將酒糟發(fā)酵為動(dòng)物飼料，或從中再提取酒精，再有就是發(fā)酵為有機(jī)肥這幾大個(gè)方面，并從其中衍生出其他的發(fā)展方向。 2．羧甲基纖維素鈉鑒定培養(yǎng)基（ CMCNa） [14]：羧甲基纖維素鈉 g、蛋白胨 g 、 K2HPO4 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 6 頁(yè) 2．檸檬酸緩沖液：稱取 4. 2 g 檸檬酸溶于 200 .0 mL 蒸餾水，配成 0. 1 mol / L 檸檬酸溶液，稱取 5. 88 g 檸檬酸三鈉溶于 mL蒸餾水，配成 0. 1 mol/ L檸檬酸三鈉溶液。 分別于 30176。以 mL 蒸餾水代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液按同樣顯色操作為空白調(diào)零點(diǎn)。 4． CMC 酶活力測(cè)定 酶液的稀釋：取大號(hào)試管 13 只，用移液管吸取離心后的酶 1 mL，加水 24 mL，搖勻。 表 菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì) 菌株編號(hào) 稀釋 102（計(jì)數(shù)） 稀釋 103（計(jì)數(shù) ） 稀釋 104（計(jì)數(shù) ） 稀釋 105（計(jì)數(shù)） 茅臺(tái)酒糟 B1 200328 2442 48 301 車間酒糟 B2 400 以上 105142 3454 713 茅臺(tái)大曲 B3 700 以上 74108 3238 414 茅臺(tái)酒醅 B4 124165 1722 411 茅臺(tái)有機(jī)高粱基地