脂肪細胞脂質代謝對肝細胞營養感應信號的影響機制論文(存儲版)

　　

【正文】 項目資助的實驗室，配備有齊全且先進的分子生物學設備及常規實驗設備，并有專門的分子生物學技術人員從事基礎實驗工作，具有完善的細胞培養及動物實驗的條件和技術，能獨立完成Western免疫印跡、同位素檢測、脂蛋白超速離心和激光共聚焦檢測等相關實驗；研究所具有一支研究經驗豐富，創新能力強的研究團隊，且多數曾有海外研究經歷。最后通過不同模型肥胖小鼠觀察肥胖對肝臟HDL 代謝的影響并探索體內注射脂肪細胞因子拮抗劑干預的作用。結果提示：在注射荷載3H標記膽固醇的巨噬細胞后，與對照小鼠比較，肥胖小鼠血清及糞便3H膽固醇放射活性在不同時間點均有降低，表示肥胖小鼠體內膽固醇逆轉運下降。提示基質膠中的細胞能與周圍組織進行正常的物質交換。（4）課題組成員已熟練掌握放射性核素標記和蛋白結合檢測、膽固醇流出測定以及各種脂蛋白成分的超速分離方法，為本課題的順利完成奠定了技術基礎。（二）課題負責人介紹趙水平，男，中南大學湘雅二醫院心血管內科主任，教授，博士后，主要從事血脂代謝與動脈粥樣硬化研究。長期從事血脂代謝異常與冠心病的研究和臨床工作。主編專著19部, 其中“臨床血脂學”于1997年出版，獲國家新聞出版基金資助，并獲衛生部科技成果二等獎。能共享我校國家遺傳學重點實驗室、腫瘤研究所等重要資源。2004年和2007年分獲衛生部重點項目資助，對高密度脂蛋白系列（包括apoAI、apoE及其模擬肽）展開了廣泛、深入的研究，發表相關研究論文18篇（其中8篇SCI文章）。3）證實基質膠中的細胞可與外周組織進行正常物質交換：盡管基質膠遇熱變為膠狀的特性有利于細胞種植和回收，但必須明確固態基質膠中的細胞與周圍組織的物質交換不會受阻。（2）本課題組初步觀察發現肥胖小鼠體內膽固醇逆轉運受損，為本研究的立題打下了基礎。（1）研究脂肪細胞內膽固醇失衡的機制：③ 培養成熟脂肪細胞和肥大脂肪細胞（3T3L1細胞促分化至21天），分別檢測其對膽固醇的攝取和流出能力以及與攝取和流出有關的蛋白表達；④ 構建腺病毒載體，分別沉默SREBP2和LXR，探討SREBP2在脂肪細胞膽固醇代謝失衡中的體制。本課題在前期研究的基礎上制定，立題理論科學，依據充分，設計方案合理，理論上有可行性。（8） 探討脂肪細胞對肝細胞CIDE表達的影響及相關通路和分子機制。六、年度計劃按年度提供研究內容及預期目標（5年）年度研究計劃（1） 脂肪細胞膽固醇代謝失衡機制探討。（4） 體內驗證脂肪細胞因子對肝細胞HDL代謝影響1) 觀察對照與肥胖小鼠（基因敲除和飲食誘導）肝臟LXRa、ApoAI、ABCA及SRBI蛋白及mRNA表達差異及血清ApoAI和HDLC水平差異，同時觀察體內注射不同脂肪因子中和抗體（如ILTNFa及瘦素抗體）后肥胖小鼠肝臟LXRa、ApoAI、ABCA及SRBI蛋白及mRNA表達及血清ApoAI和HDLC水平變化。 小鼠3T3L1前脂肪細胞，誘導分化8天成熟AcLDL＋ ACAT抑制劑AcLDL＋ ACAT抑制劑＋U18666A對照組干預結束，收集細胞及上清液檢測脂肪因子mRNA表達及上清液脂肪因子濃度Western Blot法測定胞漿蛋白IκB及磷酸化IKK、核蛋白NFκB表達水平，用EMSA法測定NFκB活性。2) 用含acLDL 50mg/L的10% LPDSDMEM誘導48 h后， Ci/ml [3H]標記的膽固醇（[3H]膽固醇）107Bq/L繼續孵育24 h，收集培養液并離心，γ射線計數儀測定放射活性，即為培養液的[3H]膽固醇放射活性，計算細胞膽固醇流出率，為培養液的[3H]膽固醇放射活性占總放射活性的百分比。具體方法為：將3T3 Ll置于含10%胎牛血清的DMEM培養液中培養，待細胞生長至完全融合后48 h開始誘導分化。四、總體目標、五年預期目標（ 總體目標和五年預期目標應從對解決國家重大需求的預期貢獻，在理論、方法、技術等方面預期取得的進展、突破及其科學價值，優秀人才培養等方面分別論述。 377:297–302.[20] Viswakarma N, Yu S, Naik S, et al. Transcriptional regulation of Cidea, mitochondrial cell deathinducing DNA fragmentation factor alphalike effector A, in mouse liver by peroxisome proliferatoractivated receptor alpha and gamma. J Biol Chem 2007。29:781786.[12] Timmins JM, Lee JY, Boudyguina E,et al. Targeted inactivation of hepatic Abca1 causes profound hypoalphalipoproteinemia and kidney hypercatabolism of apoAI. J Clin Invest. 2005。22(4):93750[6] Hu P, Han Z, Couvillon AD, Kaufman RJ, Exton JH. Autocrine tumor necrosis factor alpha links endoplasmic reticulum stress to the membrane death receptor pathway through IRE1alphamediated NFkappaB activation and downregulation of TRAF2 expression. Mol Cell Biol. 2006。在肝細胞中，CIDEB基因敲除后，固醇調節元件結合蛋白(SREBP1c)的表達明顯下降，同時影響該蛋白下游的多種酶類的活性，從而增強線粒體β氧化，降低了脂肪的合成[16]。綜上所述，我們推測：肥胖狀態下，脂肪細胞可通過旁分泌脂肪因子影響肝臟HDL代謝相關蛋白的表達和對HDL膽固醇的攝取，從而影響膽固醇逆轉運。肝臟是HDL代謝的關鍵器官，其代謝過程包括兩大方面：首先，肝臟合成ApoAI并在ATP結合盒轉運體A1（ABCA1）作用下使ApoAI脂化形成HDL，ABCA1介導的ApoAI向HDL轉化可發生在肝臟及肝臟外組織，但研究證實，選擇性敲除肝臟ABCA1可使HDLC下降80%以上[12]，提示肝臟ABCA1（而不是肝外組織ABCA1）是決定體內HDLC水平的關鍵。游離膽固醇具有顯著的細胞毒性，有研究發現，在膽固醇過度負荷的巨噬細胞，隨著膽固醇轉運至內質網，巨噬細胞則出現明顯的內質網應激[7]。有研究表明，膽固醇穩態對于維持脂肪細胞正常的生理功能具有重要意義。高脂血癥發生的原因諸多，對機體所產生損害的作用機制也非常復雜。而脂肪細胞是如何影響肝臟的脂質代謝，也將是未來幾年的研究方向和重點，這些研究可為探索高脂血癥的發病機制及防治措施提供新的思路。有研究表明，細胞內膽固醇失穩態可能是脂肪細胞功能異常的關鍵所在：用環糊精介導脂肪細胞膜膽固醇流出，模擬肥大脂肪細胞胞膜膽固醇相對減少狀態，可導致細胞表現出胰島素抵抗，分泌功能異常[4]；反之，糾正細胞膽固醇失衡，則可一定程度改善脂肪細胞的功能[5]。因此，基于以上證據，我們推測：脂肪細胞內膽固醇過度負荷，過多的膽固醇轉移至內質網，觸發細胞內質網應激，繼而導致細胞分泌功能異常，而其中IKK/NFκB通路可能在其中起介導作用。最近，我們通過比較正常及飲食誘導的肥胖小鼠體內膽固醇逆轉運功能，結果發現在注射荷載3H標記膽固醇的巨噬細胞后，與對照小鼠比較，肥胖小鼠血清及糞便3H膽固醇放射活性在不同時間點均有降低，表示肥胖小鼠體內膽固醇逆轉運下降。近年來研究發現，DNA斷裂因子相似蛋白(CIDE)家族是機體能量平衡及脂質代謝的重要調節因子，與代謝綜合征、肥胖及脂肪肝等脂類代謝相關疾病密切相關[15]。目前關于CIDE蛋白的上游調節因子的研究很有限。rg252。 322:15391543.[15] Gong J, Sun Z, Li P. CIDE proteins and metabolic disorders. Curr Opin Lipidol. 2009。② 構建腺病毒載體，分別沉默SREBP2和LXR，探討SREBP2在脂肪細胞膽固醇代謝失衡中的體制。為探討代謝綜合征及脂肪肝等疾病的發病機制及防治策略提供新的思路。再孵育48 h后，撤去胰島素，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養液培養細胞，每48 h換液一次，直到95%的細胞都為成熟的脂肪細胞。5) 比較兩組細胞的膽固醇代謝相關因子表達差異：按照步驟3) 裂解細胞，抽提細胞RNA及其蛋白，分別通過RTPCR和Western Blotting，測定細胞中膽固醇攝取相關因子（如LDLRLDL受體相關蛋白、小窩蛋白caveolin、PPARα、PPARγ）和膽固醇流出相關因子（如ABCAABCGSRBI、LXRα）的基因和蛋白表達水平，以明確兩種脂肪細胞的膽固醇代謝差異的機制（圖1）。2) 比較不同脂肪細胞共培養下培養液介導巨噬細胞膽固醇流出能力的差異。（2）探討脂肪細胞對肝細胞CIDE表達的影響及相關通路和分子機制1) 肝細胞與脂肪細胞共培養后，檢測肝細胞CIDE的基因及蛋白表達水平的變化。 （3） 建立脂肪細胞/肝細胞共培養體系，探討脂肪細胞/肝細胞共培