斑馬魚胚胎發(fā)育時期(存儲版)

　　

【正文】 C），隨后，在再一次進入有絲分裂期之前，核變大呈橄欖球形（D）。外包似乎有賴于功能微管（Strahle and Jesuthasan, 1993）并可能受控于早期作用的合子基因（Kane, 1991）。與早先卵裂不同，這一結(jié)束64細(xì)胞期的卵裂溝很不規(guī)則，以至于此后幾無例外無法從細(xì)胞位置推斷其祖系。在此期的后半部尤其在正準(zhǔn)備進入第10次有絲分裂時，外圍細(xì)胞（第一層EVL細(xì)胞）失去其連接卵黃細(xì)胞的底部邊界（圖10A,B）。第11組有絲分裂的發(fā)生猶如波線穿過胚盤，這也是最后一次發(fā)生此種情況。YSL仍是薄的環(huán)形，但其外周輪廓更為平滑。YSL在胚盤底部伸展開，同時也與胚盤分離。通常，去絨膜胚胎動物極開始豎起，而不是像先前那樣倒在一邊。胚層包被卵黃的程度提供了極有用的分期指標(biāo)。然而要完全確定背側(cè)尚需等到胚盾期（6 h）。正因為囊胚期沒有囊胚腔，原腸期既沒有消化道（archenteron），也沒有胚孔（blastopore）。比例尺=250μm發(fā)育時間（h）外包百分率圖 12. 外包期間胚層邊緣覆蓋卵黃前行的速率理想曲線（℃）。我們在75%外包期的圖1中指出了這一裂縫的所在，但用立體顯微鏡常不易定位（對比圖11和13）。環(huán)繞大部分胚胎周圍的下胚層此時只有一兩層細(xì)胞厚（圖13），目前尚不知其何以分化成內(nèi)胚層和中胚層。下胚層夾在上胚層和YSL之間。發(fā)育調(diào)節(jié)的能力可能包括合子表達模式基因（zygotically expressed patterning genes）活動的動態(tài)調(diào)節(jié)：外圍細(xì)胞特異性表達的notail基因（ntl）和鼠的T/Brachyury基因是同源基因，可編碼一種核蛋白（SchulteMerker et al., 1992），是正常的脊索發(fā)育所必需的（Halpern et al., 1993。 1976。在原腸期或原腸期后的形態(tài)發(fā)生期間驅(qū)散克隆系細(xì)胞（也是位置相關(guān)細(xì)胞），就難以形成縝密的命運圖，但情況并非總是如此。胃、胰和鰾在兩邊發(fā)育，近于肝，而平滑肌近于心臟發(fā)育。在集合運動期間，胚盤各部分的細(xì)胞都向背側(cè)流動。因此，當(dāng)胚盾形成時可以很可靠地判定胚胎最終DV軸的方向。胚盾早期，DEL細(xì)胞在上下胚層中沿整個AP軸分布，從心包區(qū)域、頭腹部，直到尾部。隨外包重新開始（），胚盾向動物極延伸，可以很清楚地看到胚層在背側(cè)比在腹側(cè)厚（圖11FH, J）。我們定義原腸期的結(jié)束為外包運動的完成和尾芽的形成（圖11L），然而這完全是人為劃分，因為在此之后尾芽中的原腸形成運動似仍在繼續(xù)。胚環(huán)期（ h）.胚環(huán)是胚層邊緣一層較厚的環(huán)形結(jié)構(gòu)，在動物極觀察可見（圖1, 11C箭頭所示）。因為胚盾將最終成為胚胎背側(cè)，同時動物極細(xì)胞將發(fā)育為頭部結(jié)構(gòu)，我們可以第一次可靠地確定AP軸和DV軸。90%外包期（9 h）.一小部分被覆蓋的卵黃細(xì)胞突出于相鄰的植物極細(xì)胞，稱卵黃栓（yolk plug , 圖11IK）。背側(cè)胚層在卵黃細(xì)胞上的集合和延伸速度比腹側(cè)胚層快，因這一不對稱性，卵黃栓消失的位點不在植物極的卵黃細(xì)胞，很大程度上在腹側(cè)。實際上，由于此期發(fā)育中尾部的發(fā)生如此顯著，注意到胚胎的整體形狀對確定分期極為有效。標(biāo)準(zhǔn)溫度下，估計前6個體節(jié)的發(fā)育速度3個/小時，而后面的體節(jié)約2個/小時（Hanneman and Westerfield, 1989）。圖15 AI圖 15 . 體節(jié)期發(fā)育。其命名主要是基于其早期發(fā)育，并不表示其發(fā)揮著諸如昆蟲肌原細(xì)胞所顯示出的必不可少的形態(tài)發(fā)生作用（Ho 等,1984），這與斑馬魚的肌原細(xì)胞相差很大。圖17. 體節(jié)形態(tài)發(fā)生。第3體節(jié)中的標(biāo)記細(xì)胞（在圖A的5注射世系追蹤染料）分化為穿越第3肌節(jié)的伸長的肌纖維（圖B突口期）。在其增大中空之前，活體胚胎不易見到，但前腎導(dǎo)管可見（圖20）。內(nèi)胚層可能僅在胚胎背側(cè)發(fā)育，位于軸中胚層和近軸中胚層之下。二次神經(jīng)胚形成是相對初次神經(jīng)胚形成而言的，后者在教科書中多有闡述，主要是通過神經(jīng)折疊的提升和匯聚由神經(jīng)板形成中空的神經(jīng)管。比例尺=50μm 圖 20 . 前腎導(dǎo)管形態(tài)發(fā)生于肛門形成區(qū)域附近。通過對鮭魚（salmonids, Ballard, 1973）和斑馬魚（Kimmel et al., 1990b）的發(fā)育研究揭示神經(jīng)板轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)管的方式在魚類和兩棲類是相同的，對此目前已有更為詳細(xì)的研究（Papan and CamposOrtega, 1994）。因為神經(jīng)胚形成和體節(jié)發(fā)生的時間多有重疊，斑馬魚發(fā)育中沒有顯著的“神經(jīng)胚期”（“neurula period”），而在兩棲動物胚胎大多在體節(jié)期前有神經(jīng)胚期。體節(jié)晚期腹側(cè)間腦隨下丘腦（hypothalamus）原基一起擴張，而松果體（epiphysis）原基是處于間腦頂中線上一個小而易見的膨出（圖23C）。經(jīng)惠允，引自 Kimmel (1993), 169。因而此時觀察者可很容易判別何處的神經(jīng)元正在發(fā)育。 Myers et al.,1986）。圖 23 . 體節(jié)期腦原基示意圖。前3個很大并有明顯刻紋（sculptured），相應(yīng)于前腦的兩個部分：間腦和端腦（diencephalon and telencephalon）以及中腦（midbrain 或 mesencephalon）。之后在分節(jié)晚期，頂面分離形成神經(jīng)管。神經(jīng)突變圓成為圓柱狀的神經(jīng)桿（C：16h）。注意到同時脊索細(xì)胞內(nèi)空泡的增大。神經(jīng)板的增厚是由于其細(xì)胞變?yōu)橹鶢睿嗵幱谏吓邔釉母箓?cè)和兩邊的外胚層細(xì)胞仍為立方體狀（圖22A）。起先只有一些看起來無序的細(xì)胞可由其位置鑒別其屬于內(nèi)胚層，它們在胚胎背側(cè)中線或附近與YSL接觸，深入下胚層主要部分。在統(tǒng)計數(shù)據(jù)時我們只計入完全形成的體節(jié)。圖19. 世系追蹤染色顯示第3體節(jié)形成第3生肌節(jié)。我們利用解剖鏡通過目鏡網(wǎng)格（ocular graticule）測得數(shù)據(jù)。最早伸長形成肌纖維的細(xì)胞似乎源于每個體節(jié)的中間體節(jié)上皮，毗鄰發(fā)育中的脊索的“近軸”區(qū)域（Thisse 等, 1993）以及背腹中側(cè)。每個體節(jié)內(nèi)的細(xì)胞將發(fā)育為生肌節(jié)（myotome），有時稱肌節(jié)（myomere或muscle segment）（圖17C；下文圖34B）。體節(jié)在軀干和尾部陸續(xù)出現(xiàn)，為分期提供了有用指標(biāo)（圖17）。體節(jié)期（1024h）此期發(fā)生了一些有趣的形態(tài)學(xué)變化：體節(jié)發(fā)生、器官原基可見、尾芽更為顯著、胚體延長（圖15）、AP和DV軸變得明確、第一次出現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)分化以及胚體開始運動。許多DEL細(xì)胞處于第16細(xì)胞周期，最早到達的有絲分裂后期細(xì)胞，包括形成脊索、軸向體節(jié)來源的肌肉以及后特定神經(jīng)元的細(xì)胞（Mendelson, 1986）。側(cè)面觀可見外圍上方胚層比腹側(cè)任何地方都薄（圖11H箭頭所示），此外排泄區(qū)，細(xì)胞通過外包和內(nèi)卷離開此處。直至胚盾晚期，外表率仍為50%，而之后可見卵黃細(xì)胞被覆蓋超過一半。特別是用解剖學(xué)顯微鏡從動物極觀察可見胚層邊緣并未明顯增厚。增厚發(fā)生于前側(cè)，始于中線，此處上胚層覆蓋軸中胚層。通過對原腸早期的胚盾細(xì)胞做移植實驗（Ho, 1992b）發(fā)現(xiàn)，軸中胚層有誘導(dǎo)形成第二胚軸的潛能。此后，隨著胚盾逐漸顯著，脊索原基（脊索中胚層）的細(xì)胞開始在背側(cè)中線內(nèi)卷。胚盾是DEL細(xì)胞沿胚環(huán)經(jīng)度約30176。原腸早期EVL細(xì)胞的位置相當(dāng)可靠地預(yù)示了其后代克隆系在后期胚胎胎皮的定位，這對于一些細(xì)胞世系和命運圖的分析是有用的（Kimmel et al., 1990b）。外胚層命運圖最靠近動物極，中胚層命運圖位于外圍廣闊的環(huán)中，而內(nèi)胚層命運圖與此環(huán)在胚層邊緣處重疊。考察神經(jīng)外胚層的命運圖：我們所看到的復(fù)雜性不僅在于其前側(cè)神經(jīng)命運圖相對應(yīng)于原腸期的背側(cè)，更在于其腹側(cè)神經(jīng)管、運動神經(jīng)元和底板的細(xì)胞種類也相對應(yīng)于此同一區(qū)域——原腸期的背側(cè)（Kimmel et al., 1990b）。通過給單個細(xì)胞注射世系追蹤染液，隨后探測其帶有標(biāo)記的后代細(xì)胞位于哪個器官的哪個區(qū)域，并根據(jù)細(xì)胞的形狀、大小和位置確定其形成了哪些分化類型。 Kimmel et al., 1990b, 1994）。箭頭示上下胚層的顯著邊界Brachet裂縫。而下胚層將產(chǎn)生中胚層（mesoderm）和內(nèi)胚層（endoderm），Thisse等（1993）稱之為“內(nèi)中胚層”（“mesendoderm”）。這一運動稱內(nèi)移運動（ingression），也可能在斑馬魚中發(fā)生（J. Shih and . Fraser，尚未發(fā)表），這是用高分辨率的時滯分析對Wood和Timmermans曾觀察過的整個細(xì)胞野做進一步研究所得。除特別標(biāo)注外均為左側(cè)觀，前側(cè)朝上，背側(cè)朝左。胚層邊緣沿卵黃細(xì)胞延伸直至將其完全包繞（圖11FL）。這一區(qū)域?qū)l(fā)育為胚胎背側(cè)（Schmitz and CamposOrtega, 1994）。30%外包期（ h）.外包運動，包括卵黃細(xì)胞的隆起，產(chǎn)生所謂的胚層（blastoderm），厚度幾乎一致（圖8F）。EYSL通常比前期明顯變薄，大部分YSL細(xì)胞核是內(nèi)在的。此時，卵裂高度不同步，其中許多處于第12或13次細(xì)胞周期。在整個高囊胚期胚盤的任一區(qū)域總有一些細(xì)胞處于間期，而另一些細(xì)胞則處于有絲分裂期。在某些胚胎，YSL經(jīng)由兩個細(xì)胞周期才形成，其開始時間可能早于也可能晚于1 k細(xì)胞期。512細(xì)胞期（2. 75 h）.此期開始囊胚中期轉(zhuǎn)變；細(xì)胞周期在后幾次分裂中不斷延長（圖9A）。但其發(fā)育潛能在囊胚晚期似并未受到限制，如將其逐個移至深層細(xì)胞，其子代將獲得新的分化方向。在隨后的數(shù)小時內(nèi)，隨外包的繼續(xù)，EYSL也繼續(xù)前行，穿過卵黃直達依附其上的細(xì)胞前方。A：第10細(xì)胞周期間期的外圍卵裂球（512細(xì)胞期，箭頭指示其細(xì)胞核）。在這一形態(tài)發(fā)生運動的早期，胚盤高度變薄，從高高隆起的細(xì)胞堆疊（圖8B）變?yōu)閹缀跬缓穸鹊谋瓲疃鄬蛹?xì)胞（圖8F）。YSL核開始增大，可能表示其正在活躍地轉(zhuǎn)錄RNA。YSL形成后，原先在胚盤第二層的EVL細(xì)胞成為最外層。MBT開始后的任意時刻，一些細(xì)胞處于間期，可用Nomarski光鏡很容易看到細(xì)胞核（圖10A,D），而另一些細(xì)胞處于有絲分裂期（無核，圖10C,E），因而形態(tài)學(xué)上可明顯看到不同步性。比例尺=250μm囊胚早期細(xì)胞繼續(xù)同步分裂，和之前節(jié)奏相同（圖5，9）。此期有很多重要事件發(fā)生：胚胎進入囊胚中期轉(zhuǎn)變（midblastula transition, MBT）、卵黃合胞體層（the yolk syncytial layer, YSL）形成、外包（epiboly）開始。側(cè)面觀，在外圍和動物極之間常可見雙層細(xì)胞。在4細(xì)胞期，細(xì)胞L處于第1次卵裂面左側(cè)，細(xì)胞R處于右側(cè)（因此，這里的標(biāo)號L和R并非指未來胚體的左右側(cè)；見正文）。此四分體在圖6E中完全被其他細(xì)胞包繞。圖 5 . 受精后（℃），卵裂球數(shù)目隨時間變化的理想曲線，此段時間卵裂發(fā)生較為同步，在第10細(xì)胞周期的囊胚中期轉(zhuǎn)變之前。圖 4 . 卵裂期胚胎。形成的兩個卵裂球體積相同，似乎不易相互區(qū)分。約在細(xì)胞周期的前半部分，即細(xì)胞間期，細(xì)胞核存在且可見，核形態(tài)也發(fā)生系統(tǒng)性變化（見下，圖10）。A：受精后數(shù)分鐘，絨膜膨脹。因為吹打、去絨膜、麻醉等處理會顯著阻滯發(fā)育，如此處理的胚胎比長胸鰭期的對照組晚26小時。A：尾芽期，B：突口期。將胚胎包埋于蓋玻片之間，有時加1%瓊脂以固定。比例尺=250μm 對活體胚胎進行分期總是比將其致死和固定后再分期要好。此外，“原基”期（”prim” stages）指后側(cè)線原基（primordium of the posterior lateral line）這一結(jié)構(gòu)的位置，我們必須利用Nomarski光學(xué)系統(tǒng)以準(zhǔn)確確定大部分咽囊期的一些分期。我們可以利用這些資料大致定位我們所感興趣的一個分期，然后盡可能在文中和其他圖中找到更多細(xì)節(jié)。；1/2OVL1；YE/YB=。例如：我們現(xiàn)在描述了一個5，隨后又描述了一個14，但一項特定的研究可能要用到其間的8個分期（6體節(jié)，7體節(jié)等等），此時我們可以立刻明白其含義（而不必再行描述）。以往的斑馬魚發(fā)育分期盡管不如目前的完善，也相當(dāng)準(zhǔn)確地反映了頭一天的胚胎發(fā)育，并提供了多組有用的圖片（Hisaokaand Battle, 1958。體外同時受精產(chǎn)生的胚胎，孵育于溫度合適的稀疏環(huán)境（℃，510個胚胎/ml），最早期即出現(xiàn)不同步性，并隨時間延續(xù)愈加顯著。這一劃分強調(diào)了發(fā)生于受精后頭3天的主要發(fā)育過程中的變化情況，同時我們也回顧了發(fā)生于每一時期的諸如形態(tài)發(fā)生及其他主要事件。各分期的命名是基于用解剖立體顯微鏡（dissecting stereomicroscope）觀察活體胚胎所容易觀察到的形態(tài)學(xué)特征為依據(jù)的，同時也充分利用了活體胚胎的透明性，這一性質(zhì)使我們可以用組合顯微鏡（pound microscope）和Nomarski干涉相差照明（Nomarski interference contrast illumination）觀察到即使很深層的結(jié)構(gòu)。就不同胚胎而言，通過形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分期可部分解決這一問題。本系列分期的先前版本見于已出版和發(fā)行的《斑馬魚手冊》（The Zebrafish Book，Westerfield,1994）一書。；側(cè)向條紋；耳石（otoliths）；原基3咽囊期原基524EL=；HTA=120176。；OVL=1/2；PF(H/W)=2；背上位靜息；YE開始變細(xì)，PF突出；背腹側(cè)條紋匯于尾部；側(cè)帶約6個黑素細(xì)胞；視網(wǎng)膜上虹膜色素細(xì)胞豐富；頭部顯著黃色；NO：循環(huán)見于24大動脈弓及血管段；嗅覺纖毛擺動；半規(guī)管（semicircular canal）；神經(jīng)丘（neuromast）胸鰭60EL=；HTA=35176。此時，我們必須將胚胎移出絨膜，可以使用5號鑷子（forceps）手工移去，也可用蛋白溶解酶（proteolytic enzyme）處理。早期動物極位于頂端，后來前緣成為頂端，例外的是原腸胚的胚環(huán)和胚盾期在其側(cè)面觀的圖片下顯示了相應(yīng)的動物極（AP）觀圖片。成像所附圖片均為活體胚胎，后期為麻醉處理。例如，使兩個胚胎在某一時間達到不同的分期以作異時移植。注意到25℃和33℃下的發(fā)育曲線均為直線，且斜率在兩圖中幾乎相同。合子期的分期1細(xì)胞期（0 h）.絨膜膨脹并脫