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基因表達和基因重組(存儲版)

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【正文】 HⅠ 切割 GCC TA GGCC TA GGA TC CGGA TC CG重組體 GCC TA GGCC TA GGA TC CGGA TC CGGCC TAGCC TAGA TC CGGA TC CG載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接 GAATT CCT TAAG AGA TCTTC TAGAEco RⅠ 切割位點 GCTTAAATCTAGA ATTCGGATCTABg lⅡ 切割位點 AATTC GATC TAGA ATTCGGATCTAAATTC G ATC TAG+ EcoRⅠ + Bg lⅡ 雙酶切 Eco RⅠ + Bg lⅡ 雙酶切 GCTTAAATCTAGA ATTCGGATCTAT4 DNA連接酶 15186。載體 DNA 5180。 5180。 5180。 Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態 (petent) 導入方式轉化 (transformation) 轉染 (transfection) 感染 (infection) （四）重組 DNA導入受體菌（五）重組體的篩選 1. 直接選擇法 (1) 抗藥性標記選擇 (2) 標志補救 (marker rescue) (3) 分子雜交法原位雜交 Southern印跡 2. 免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等 (插入失活法) 抗藥性標記選擇 α互補 α 互補的檢測原位雜交 Southern印跡雞的 β肌球蛋白的克隆和檢出重組 DNA技術操作過程可形象歸納為小結分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉轉入受體菌篩篩選重組體重組 DNA技術操作的主要步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組 DNA cDNA 人工合成 PCR產物限制酶消化開環載體 DNA 目的基因連接酶重組體轉化體外包裝，轉染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交表達體系的建立表達載體的構建受體細胞的建立表達產物的分離純化（六）克隆基因的表達 1. 原核表達體系（）標準：選擇標志強啟動子翻譯調控序列多接頭克隆位點不宜表達真核基因組 DNA 不能加工表達的真核蛋白質表達的蛋白質常形成不溶性包涵體 (inclusion body) 很難表達大量可溶性蛋白大鼠胰島素原 cDNA 的表達和分泌優點：可表達克隆的 cDNA及真核基因組 DNA 可適當修飾表達的蛋白質表達產物分區域積累缺點：操作技術難、費時、經濟轉染 —— 將表達載體導入真核細胞的過程方法：磷酸鈣轉染 DEAE葡聚糖介導轉染電穿孔脂質體轉染顯微注射 2. 真核表達體系酵母、昆蟲、乳類動物細胞表達載體 pFASTBACI 的物理圖譜（一）疾病基因的發現與克隆根據基因定位克隆之并研究其性質，而認識疾病的分子機制。目錄演講完畢，謝謝觀看！。人工接頭及其應用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5180。

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