基因診斷與基因治療培訓教程(存儲版)

　　

【正文】 錄目 反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點；l 輔助細胞株 (如 PA317)： 由另一種缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒（即帶有全套病毒包裝蛋白基因，但缺失包裝信號 ψ的反轉(zhuǎn)錄病毒）感染構(gòu)建而成。system目 目 （ 2）腺病毒 (adenovirus)載體腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。錄目 分裂增殖 AAV不能獨立復制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒等）存在時，才能進行復制和溶細胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。Genomic 錄目 目 這樣形成的復合物可被帶有特異性受體的靶細胞吞飲，從而將外源 DNA導入靶細胞。 錄錄 RNA技轉(zhuǎn)移術(shù) 反義 RNA的優(yōu)點 核酶錘頭狀的二級、三級結(jié)構(gòu)目 RNA干擾 （ RNA而且其抑制基因表達的效率比反義 RNA至少高 2個數(shù)量級。plex,長雙鏈 RNA被細胞內(nèi)的雙鏈 RNA特異性核酸酶 Dicer切成 21~23個堿基對的短雙鏈 RNA，稱為小干擾性 RNA（ smallRNA干擾技術(shù)能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達，建立多種表型；抑制基因表達的時間可以控制在發(fā)育的任何階段。錄1.可供選擇并符合上述 4條以上要求的不過只有 30余種遺傳病。n 血友病和其他血漿蛋白缺乏癥 （ 2）抑制癌基因的活性，通過干擾癌基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮抑癌作用；（ 3）增強腫瘤細胞的免疫原性，通過對腫瘤組織進行細胞因子修飾，刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對腫瘤細胞的溶解和排斥反應；（ 4）通過導入 “自殺基因 ”殺傷癌細胞。目 主要包括：目 （ 2）將能夠誘導機體產(chǎn)生保護性免疫應答的病毒抗原基因，如乙型肝炎病毒表面抗原基因等，導入機體，表達的抗原不僅可以誘導機體產(chǎn)生保護性抗體，還可以引發(fā)特異性的細胞免疫應答，產(chǎn)生對野生型致病病毒攻擊的防御作用。錄 五、基因治療的問題與展望n 治療基因調(diào)控元件的選擇n 安全高效載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)移技術(shù)的選擇n 靶細胞的選擇目 三月 21三月 2113:18:5913:18:59March 22, 20231他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國見青山。 13:18:5913:18:5913:18Monday, March 22, 20231不知香積寺，數(shù)里入云峰。 三月 2113:18:5913:18Mar2122Mar211越是無能的人，越喜歡挑剔別人的錯兒。 2023/3/22 13:18:5913:18:5922 March 20231一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。 三月 21三月 21Monday, March 22, 2023閱讀一切好書如同和過去最杰出的人談話。 13:18:5913:18:5913:183/22/2023 1:18:59 PM1成功就是日復一日那一點點小小努力的積累。 三月 2113:18:5913:18Mar2122Mar211故人江海別，幾度隔山川。主要包括：目 目 錄錄細胞因子（或受體）基因治療；耐藥基因治療。錄目 (PNP)缺乏癥 錄四、基因治療的應用研究 目 該復合體可識別與 siRNA有同源序列的 mRNA， 并在特異的位點將該 mRNA切斷（ 1）小干擾性 RNA（ siRNA）（ 2） siRNA與細胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復合體，稱為 RNA誘導的沉默復合體（ RNAinduced RNA） 均能抑制線蟲基因的表達，雙鏈 RNA比單鏈 RNA更為有效。更重要的是，核酶在切斷 mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的 mRNA分子。錄目 錄反義 RNA的關(guān)鍵技術(shù)問題?反義 RNA進入靶細胞前的降解問題?專一性轉(zhuǎn)移問題 （ 2）構(gòu)建一些能轉(zhuǎn)錄反義 RNA的重組質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞中，轉(zhuǎn)錄出反義 RNA而發(fā)揮作用。目 （ 3）基因直接注射技術(shù)這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實現(xiàn)。kb外源 DNA片段；感染效率比反轉(zhuǎn)錄病毒載體低 ,在 40% ~80% 的成人中存在過感染 。AAV可以高效定點整合至人 19號染色體的特定區(qū)域 ，并能較穩(wěn)定地存在。AAV其基因組 DNA小于 5 kb外源基因。隨機整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險；④ 包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體）以出芽的方式分泌至輔助細胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。③ 前病毒通過 LTR高效整合至靶細胞基因組中，有利于外源基因在靶細胞中的永久表達。② 反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因 gag、 env和 pol的缺失不影響其他部分的活性。① 反轉(zhuǎn)錄病毒包膜上 env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動物細胞膜上的特異性受體識別，從而使反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進入靶細胞。錄Retroviral—— 由兩部分組成反轉(zhuǎn)錄病毒載體： 其基因組為缺陷型，保留了病毒的包裝信號 ψ，而缺失病毒的包裝蛋白基因；它可以克隆并表達外源治療基因，但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。l gag基因，編碼核心蛋白和屬特異性抗原；l pol基因，編碼反轉(zhuǎn)錄酶；l env基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白 (包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白 )。p 病毒有三個結(jié)構(gòu)基因p 5ˊ端 LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列（ ψ）及剪接供體位點 (SD)和剪接受體位點 (SA)。錄p 兩端各有一長末端重復序列 LTR。目 旁觀者效應（ bystanderkinase,Gene目 帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點，進行部分基因序列的交換。錄目 多位點 VNTR系統(tǒng)和 DNA指紋圖的電泳分離后片段數(shù)目較多，各等位基因頻率分布的計算復雜，進行親權(quán)鑒定和個體識別時匹配概率的計算影響因素較多，目前尚無一個公認的最合理的計算方法。目 目 polymorphism,目 可變數(shù)目串聯(lián)重復序列 (VNTR)重復單位 2～ 6of Kras原癌基因突變也是結(jié)腸癌形成的早期事件。錄（二）結(jié)腸癌乳腺癌高危家族中常有抑癌基因的 BRCA基因（ breast錄3．抑癌基因 p53的檢測 錄錄目 錄三、寄生蟲及衣原體感染n 瘧原蟲 DNA，以便分型。 錄脆性 X綜合征常用基因診斷方法1． PCRASO島未被甲基化，稱為前突變（ premutation）。X在一些重型甲型血友病家系中還有其他異常帶型出現(xiàn)。I或 BclFVIII基因倒位的 DNA印跡分析bp的片段太小，在 ％的瓊脂糖凝膠中不易被觀察到（二） ?珠蛋白生成障礙性貧血癥目 I。錄1.(CCT GTG G)鐮狀紅細胞貧病的限制性內(nèi)切酶譜分析MstⅡ 酶切位點 （ CCTNAGG）2.TCTAAG目 二、血友病（ Hemophilia） 錄目 (shorttandem多在進化中形成，本身并不致病，只是與某些遺傳性致病基因有一定連鎖關(guān)系。錄目 PCRASO、PCR產(chǎn)物直接測序5/——5 /—3 /3/—（ 2）無限制性酶切位點改變 目 錄目 錄目 Ⅰ 限制性內(nèi)切酶位點的變化目 錄目 錄 （四）限制性片段長度多態(tài)性分析 （ restriction錄目 錄PCRSSCP分析原理示意目 SSCP）錄目 reaction,錄目 FISH）n 掛鎖 FISHASO）目 目 錄目 Southernacidn 生物芯片（ biochips） n 聚合酶鏈式反應 (PCR) 高特異性252。目 目 YW用核酸分子雜交技術(shù)首次對一例 α地中海貧血進行診斷。錄目 錄基因診斷的特點252。hybridization） 錄（一）核酸分子雜交 Nucleic1.blotting)目 將 RNA或 DNA變性后直接點樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達產(chǎn)物的定性及定量的研究。錄oligonucleotide,hybridization,錄目 錄熒光原位雜交（ FISH）目 chain錄1.多重 PCR 多重 PCR示意圖 A：普通 PCR； B：多重 PCR目 polymorphism,目 錄目 目 錄A B C D E F G－＋DEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG－ ＋C +DAEcoR錄目 錄左側(cè)：正常；右側(cè)突變 序列分析用于基因診斷研究目 錄基因診斷中常用的分子生物學方法比較方法 優(yōu)點與問題 解決方案核酸分子雜交 結(jié)果可靠但操作繁瑣 選擇合適的探針 PCR 靈敏度、特異性高 設計合適的引物 SSCP 操作簡便、檢出率不高 選擇合適的片段 RFLP 結(jié)果可靠但限制較多 選擇合適的限制酶 DNA測序 可自動化，但不適宜廣泛使用 與 PCR配合使用生物芯片 效率高，成本高，不適宜廣泛使用選擇合適的芯片目 錄目 錄斑點雜交、反向斑點雜交ASPCR、 PCRSSCP、 錄目 錄BamHI BamHIα2 α1α2 10 kb14 kbprobe ?珠蛋白生成障礙性貧血 的直接基因診斷?珠蛋白 基因不同程度的缺失可引起不同類型的 ?珠蛋白生成障礙性貧血目 基因表達異常的檢測 ofSTR——RFLP 標記的連鎖分析H