微生物檢驗技術(shù)-文庫吧在線文庫

　　

【正文】 附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。　　４）加碘液覆蓋涂面染1分鐘。一、物理方法溫度　　利用溫度進行滅菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。另一方面高溫水蒸汽對蛋白質(zhì)有高度的穿透力，從而加速蛋白質(zhì)變性而迅速死亡。　　：上述兩種方法在常壓下，只能起到消毒作用，而很難做到完全無菌。　　d. 加壓蒸汽滅菌法：這是發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)療保健、食品檢測和微生物學實驗室中最常用的一種滅菌方法。　　在加壓蒸汽滅菌中，要引起注意的一個問題是，在恒壓之前，一定要排盡滅菌鍋中的冷空氣，否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對應關(guān)系，這樣會大大降低滅菌效果。一般地講，蛋白質(zhì)、糖或脂肪存在，則提高抗熱性，pH在7附近，抗熱性最強，偏向兩極，則抗熱能力下降，而不同的鹽類可能對滅菌產(chǎn)生不同的影響；固體培養(yǎng)基要比液體培養(yǎng)基滅菌時間長。　　２）應用β射線作食品表面殺菌，γ射線用于食品內(nèi)部殺菌。　　能迅速殺滅病原微生物的藥物，稱為消毒劑。有的還要進行包裝，經(jīng)過滅菌等準備就緒后，才能使用。二、培養(yǎng)基的類型　　在實驗室中配制的適合微生物生長繁殖或累積代謝產(chǎn)物的任何營養(yǎng)基質(zhì)，都叫做培養(yǎng)基(Media)。　　２）合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是一類化學成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基，它是用已知化學成分的化學藥品配制而成。常用作凝固劑的物質(zhì)有瓊脂、明膠、硅膠等，以瓊脂最為常用。如鏈霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生長；而制霉菌素、灰黃霉素等能抑制真核微生物的生長；結(jié)晶紫能抑制革蘭氏陽性細菌的生長等。它含有膽鹽、乳糖和中性紅。３、培養(yǎng)基成分的稱取　　培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯亂，最好一次完成，不要中斷。如為瓊脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混合。　　瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。　　將全部培養(yǎng)基放入36177。接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)　　一、接種　　將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。　　４）澆混接種 該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45176。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。用于接種的器具必須經(jīng)干熱或火焰等滅菌。在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。　　　　圖３－６　平板劃線分離法 ５、厭氧法　　在實驗室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。影響微生物生長的因素很多，簡要介紹如下。２）溫度　　在一定的溫度范圍內(nèi)，每種微生物都有自已的生長溫度三基點：最低生長溫度、最適生長溫度和最高生長溫度。　　根據(jù)微生物最適生長溫度的不同，可將它們分為三個類型：　　：其是適生長溫度多數(shù)在10℃－20℃之間　　：其最適生長溫度一般在20℃－45℃之間　　：生長溫度在45℃以上。沒有氧氣，便不能生長，但是高濃度的氧氣對需氧微生物也是有毒的。　　　　這類微生物在生長過程中，不需要分子氧。這類微生物在培養(yǎng)時，不需要氧氣參加。　　固質(zhì)培養(yǎng)：是將菌種接至疏松而富有營養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中，在合適的條件下進行微生物培養(yǎng)的方法。在液體培養(yǎng)中的表面生長情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。因此微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍和Andrade指示劑。立即檢視結(jié)果，陽性反應（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉湯顏色無變化。C培養(yǎng)48h，培養(yǎng)液1ml加O’Meara試劑（%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml，搖動試管1~2min，靜置于室溫或36177。Cα萘酚（2naphthol）,再加40%，搖動2~5min，陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36177。　　試驗方法：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于通用培養(yǎng)基，培養(yǎng)于36177。５、靛基質(zhì)（Imdole）試驗　　某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。　　試驗方法：臨試前將試劑的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，立即或于10min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗陽性，若無紅色出現(xiàn)則為陰性。1℃。或涂布并穿刺接種于瓊脂斜面，不要到達底部，留底部作變色對照。1℃培養(yǎng)24~28h，培養(yǎng)基呈黑色為陽性。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。　　血清學反應的一般特點：　　1)抗原體的結(jié)合具有特異性，當有共同抗原體存在時，會出現(xiàn)交叉反應。　　習慣上將經(jīng)典的血清學反應分三種類別：凝集反應、沉淀反應和補體結(jié)合反應。常用于鑒定菌種、血型。因為要測定抗體的含量，故將待檢查的血清用等滲鹽水倍比稀釋成不同濃度，然后加入等量抗原，37℃或56℃，2~4小時觀察，血清最高稀釋度仍有明顯凝集現(xiàn)象的，為該抗血清的凝集效價。　　１）環(huán)狀沉淀反應：是一種定性試驗方法，可用已知抗體檢測未知抗原。可用于免疫蛋白含量的測定。如果出現(xiàn)溶菌，是補體與待檢系統(tǒng)結(jié)合的結(jié)果，說明抗原抗體是相對應的，如果出現(xiàn)溶血，說明抗原抗體不相對應。如果可能盛樣品的容器在最初進入加工區(qū)之前應當被預先標識，象樣品號、取樣日期、取樣人等。檢查觀看干冰袋子是否有接觸，如果泄漏可能污染樣品，你也可以用濕冰，濕冰可以由工廠提供，然而取樣前必須清楚這一點，如果想保持樣品冷凍，干冰應在檢驗前獲得。　　滅菌全包裝袋：　　袋子必須購買滅菌的，使用時只需撕掉封頭，用提供的地方張開袋子，將樣品放入，然后將袋子頂端卷起，用線繩扎實牢；底部應當折疊兩次，以便線繩不會穿透塑料袋，導致樣品泄露。無論采取何種方法抽樣，每批貨物的抽樣數(shù)量不得少于5件。在進行詳細敘述之前，先解釋四個代號：　　n：系指一批產(chǎn)品采樣個數(shù)。M即附加條件后判定合格的菌數(shù)限量。例如：冷凍生蝦的細菌數(shù)標準n=5，c=3，m=101，M=102，其意義是從一批產(chǎn)品中，取5個檢樣，經(jīng)檢樣結(jié)果，允許≤3個檢樣的菌數(shù)是在mamp。這個設想是很科學的，符合實際情況的，對生產(chǎn)廠及消費者來說都是比較合理的。例如冷凍食品，細菌數(shù)按例2，大腸菌按例5，金黃色葡萄球菌按例8，沙門氏菌按例11的二級法判定。冷凍加工蝦，為了不加熱就食，在解凍中有增強危害度的可能性，適用例12，對象微生物特別指定金黃色葡萄球菌腸毒素，兩者雖菌數(shù)限量是相同的，但情況有所不同，分別適用c=3，c=1，因此不依靠菌數(shù)限量，而用合格率來控制。如點在第48行、第10列的數(shù)字上。容器必需清潔、干燥、防漏、廣口、滅菌，大小適合盛放檢樣。　　（2）．在將樣品送達實驗室前，要始終保持樣品處于冷凍狀態(tài)。　　（1）抽樣結(jié)束后應盡快將樣品送往實驗室檢驗。1．樣品的標記　　（1）所有盛樣容器必須有和樣品一致的標記。2．統(tǒng)裝或大容器包裝的液體食品：　　（1）．抽樣前搖動或用滅菌棒攪拌液體，盡量使其達到均質(zhì)；　　（2）．抽樣時應先將抽樣用具浸入液體內(nèi)略加漂洗，然后再取所需量的樣品，裝人滅菌盛樣容器的量，不應超過其容量的四分之三，以便于檢驗前將樣品搖勻；　　（3）．取完樣品后，應用消毒的溫度計插入液體內(nèi)測量食品的溫度，并作記錄。　　。其使用方法如下：　　（如箱、包、盒等）按順序編號。沙門氏菌水活性在0、94以下不能繁殖，適用例11，如上所述，應根據(jù)各種食品的危害度進行設定。“增加”系指將食品保存在不良環(huán)境中使微生物易于繁殖和產(chǎn)毒。M值之間或一個檢樣菌數(shù)超過M值者，則判定該批產(chǎn)品為不合格品。以生食海產(chǎn)品魚為例n=5，c=0，m=102，n=5即抽樣5個，c=0即意味著在該批檢樣中，未見到有超過m值的檢樣，此批貨物為合格品。1．ICMSF的采樣方法　　有些實驗室在每批產(chǎn)品中，僅采一個檢樣進行檢驗，該批產(chǎn)品是否合格，全憑這個檢樣來決定。　　在“多批”（Lots或“batchers”）食品的情況下就不能如此抽樣，因為“一批”容易包含在微生物的質(zhì)量上差異很大的多個單元。二、取樣方案　　微生物檢驗的特點是一個以小份樣品的檢測結(jié)果來說明一大批食品衛(wèi)生質(zhì)量，因此，用于分析的樣品的代表性至關(guān)重要，也即樣品的數(shù)量、大小和性質(zhì)對結(jié)果判定產(chǎn)生重大影響。　　所有取樣設施和容器的滅菌日期應當被檢查、滅菌時間應當在儀器設施的標簽和包裝上標明，一些儀器設施可以在當?shù)貙嶒炇覝缇幚砘蛸徺I滅菌儀器，在當?shù)貙嶒炇覝缇膬x器設施一般可以保持至少兩個月，過期后設施必須重新滅菌。2．生產(chǎn)線樣品InLine Samples：　　生產(chǎn)線樣品一般是指原材料，原料生產(chǎn)用水、包裝材料或其他任何使用在生產(chǎn)線的材料。　　無菌樣品的采集基本是為了支持、針對工廠的衛(wèi)生條件狀況的檢查結(jié)果。補體無特異性，能與任何一組抗原抗體復合物結(jié)合而引起反應。每對抗原抗體可形成一條沉淀線。就出現(xiàn)肉眼可見的反應，敏感性很高。是一種定量試驗方法。　　１）直接凝集反應　　顆粒性抗原與相應抗體直接結(jié)合所出現(xiàn)的反應，稱為直接凝集反應(Direct agglution reaction)。第一階段為抗原體特異性結(jié)合階段，反應速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應即可完畢，但不出現(xiàn)肉眼可見現(xiàn)象。培養(yǎng)基未接種的下部，可作為對照。紙條變黑為陽性。陰性者無顏色改變。８、尿素酶（Urease）試驗　　有些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。７、明膠（Gelatin）液化試驗　　有些細菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。1C培養(yǎng)24h時后，取約2ml培養(yǎng)液，加入Kovacs氏試劑2~3滴，輕搖試管，呈紅色為陽性，或先加少量乙醚或二甲苯，搖動試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。C較好）3~5天，從第二天起，每日取培養(yǎng)液1ml，加甲基紅指示劑1~2滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。C水浴放置2h后判定結(jié)果者。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時制備為妥。1176。接種后，置36177。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無限伸長沿培養(yǎng)基表面蔓延。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的細菌在一定條件下，培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。　　：這也有很多方法，主要有：用焦性沒食子酸吸收氧氣；用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧混合培養(yǎng)吸收氧氣；用植物組織如發(fā)芽的種子吸收氧氣；用產(chǎn)生氫氣與氧化合的方法除氧。就是說這種微生物在培養(yǎng)時，需要有氧氣加入，否則就不能生長良好。在無氧氣存在的條件下，它進行發(fā)酵作用，例如酵母菌的無氧乙醇發(fā)酵。但是微生物只能在水溶液中生長，而不能生活在純水中。超過最高生長溫度，微生物也要停止生長，溫度過高。然而營養(yǎng)太低時，細菌生長就會遇到困難，甚至還會死亡。有時為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。所創(chuàng)造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。單一細胞經(jīng)過多次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。平板接種時，通常把平板的面傾斜，把培養(yǎng)皿的蓋打開一小部分進行接種。光滑是便于用消毒劑擦洗；水平是倒瓊脂培養(yǎng)基時利于培養(yǎng)皿內(nèi)平板的厚度保持一致。　　６）液體接種 從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中，都可稱為液體接種。　　３）穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常采用此法。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時，需要用到涂布棒。應追查原因并重復接種一次，如結(jié)果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應棄去，不能使用。C左右的培養(yǎng)基中。分裝容器應預先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒，以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。即將冷卻至55~60176。因此，對這個步驟，操作者應隨時注意探索經(jīng)驗、以期能掌握培養(yǎng)基的最終PH，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細菌不易生長。還有專門用于培養(yǎng)病毒等寄生微生物的活組織培養(yǎng)基，如雞胚等；專門用于培養(yǎng)自養(yǎng)微生物的無機鹽培養(yǎng)基等。這樣的培養(yǎng)基稱之為鑒別培養(yǎng)基。以瓊脂為例，~1%之間。這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實踐和實驗室中使用最多。　　１）天然培養(yǎng)基 天然培養(yǎng)基是指利用各種動、植物或微生物的原料，其成分難以確切知道。有可能被病原菌污染的器皿，必須經(jīng)過適當消毒后，將污垢除去，用皂液洗刷，再用流水沖洗干凈。由于消毒防腐劑沒有選擇性，因此對一切活細胞都有毒性，不僅能殺死或抑制病原微生物，而且對人體組織細胞也有損傷作用，所以只能用于體表、器械、排泄物和周圍環(huán)境的消毒。這種滅菌方法適用于一些對熱不穩(wěn)定的體積小的液體培養(yǎng)基的滅菌以及氣體的滅菌。　　。C，12分鐘才被殺死。加壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)的溫度可達到121176。然后冷卻，放入37176。此法為法國微生物學家巴斯德首創(chuàng)，故名為巴氏消毒法。　　：這是實驗室中常用的一種方法，即把待滅菌的物品均勻地放入烘箱中，升溫至160176。干燥，鏡檢。所以脫色時間，脫色方法也應嚴格控制。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。使用酸性染料時，必須降低染液的PH值，使其呈現(xiàn)強酸性（低于細菌菌體等電點），讓菌體帶正電荷，才易于被酸性染料染色。復染色法是用兩種或兩種以上染料，有協(xié)助鑒別微生物的作用。６、復染　　脫色后再用一種染色劑進行染色，與不被脫色部位形成鮮明的對照，便于觀察。染色　　標本固定后，滴加染色液。固定　　標本干燥后即進行固定，固定的目的有三個：　　１）殺死微生物，固定細胞結(jié)構(gòu)。當培養(yǎng)基因糖類分解產(chǎn)酸使pH