基因診斷與基因治療培訓(xùn)教程(完整版)

　　

【正文】 g） n 免疫組織化學(xué)診斷 錄核酸分子雜交流程 待測核酸制備濾膜上核酸固化雜交去除未雜交的探針檢測雜交信號核酸探針制備探針標(biāo)記加入標(biāo)記探針目 錄RNA經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，通過分子雜交檢測特定的 mRNA分子的含量與大小。blotting）改變了傳統(tǒng)雜交方法中一次雜交只能檢測一種樣品的局限，大大提高了基因診斷的效率 。等位基因特異性寡核苷酸with固相夾心雜交法(sandwich錄目 錄目 錄目 錄（三） 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（ singlestrandRFLP）由于 DNA設(shè)計適當(dāng)?shù)臄U增引物，使擴增片段包括某一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別序列，在 PCR擴增后用該限制酶切割 PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長度變化，即可作出診斷。sequencing）目 錄目 錄（一）直接診斷途徑 必要條件：◆ 被檢測基因變化與疾病發(fā)生有直接因果關(guān)系◆ 被檢基因正常分子結(jié)構(gòu)已被確定◆ 被檢基因致病的分子機制（突變位點或表達(dá)變化）已知目 2. 基因重排的檢測核酸分子探針雜交與 PCRspecificmRNA的相對定量分析錄目 錄VNTRnucleotide（一）鐮狀細(xì)胞貧血病 錄目 ACTn 突變的（ M）的 ASO探針：CCT錄斑點雜交結(jié)果 N：正常； M突變鐮狀紅細(xì)胞貧血患者 ASO雜交法檢測NASOMASO正常 突變 突變純合子 雜合子 純合子5180。錄目 錄3.bA；4： bT/n 甲型血友病的基因突變類型已有 300余種，其中點突變占 174種；另有部分患者是由于缺失或插入突變或內(nèi)含子 22的基因倒位所致。kb三種類型。錄2.n 正常人中約為 n 全突變可關(guān)閉相鄰 FMR1基因的表達(dá)， FMR1 第三節(jié) 傳染病的基因診斷 Gene Diagnosis of Infectious Diseases目 錄二、細(xì)菌引起的疾病n 結(jié)核分枝桿菌 先設(shè)計一對特異性引物，用 PCR技術(shù)擴增出一 383診斷方法：核酸雜交和 PCR技術(shù)n p53的基因診斷方法有BRCA1在 N端的一半部位截短，與乳腺癌和卵巢癌的高風(fēng)險相關(guān)；而在 C端截短則主要與乳腺癌高危有關(guān)。二、常見腫瘤的基因診斷目 錄目 錄n 重復(fù)序列以各自核心序列（重復(fù)單元）首尾相連多次重復(fù)，稱為串聯(lián)重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)在人群中存在變異，形成多態(tài)性。錄目 DNA長度多態(tài)除可用 Southern印跡雜交法檢測外，還可以通過 PCR擴增后電泳來檢出。錄目 錄1．單位點探針檢測及 PI值的計算目前解決親權(quán)糾紛最簡單的辦法是先在孩子 DNA指紋圖中找出非母片段并計數(shù)為 P，然后分析爭議父 DNA指紋圖，看 P條非母帶在爭議父中出現(xiàn)多少條。錄 狹義基因治療： 指目的基因?qū)氚屑?xì)胞后與宿主細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生整合、成為宿主基因組的一部分，目的基因表達(dá)產(chǎn)物起治療疾病的作用。 生殖細(xì)胞 (germline)基因治療v 只限于某一體細(xì)胞的基因的改變v 只限于某個體的當(dāng)代v 對缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正v 當(dāng)代及子代目 目的： 將缺陷基因的異常序列進(jìn)行橋正。錄（二） 基因添加 （ gene目 單純皰疹病毒（ herps錄錄 病毒載體 介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。 反轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納 7腺病毒是一種大分子 (36 目 VirusCAP：編碼衣殼蛋白的基因ITR：反向末端重復(fù)序列目 整合 致病性 感染細(xì)胞 克隆容量反轉(zhuǎn)錄病毒 載體隨機整合，效率高可能致病 分裂細(xì)胞 7kb腺病毒載體 不整合，可能丟失不致病 分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞錄目 錄目 不需要進(jìn)行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露DNA注入動物肌肉或某些器官組織內(nèi)。錄三、基因干預(yù) （ gene interference） 目 反義 RNA與基因表達(dá)調(diào)控 ① 受體介導(dǎo)的 RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；② 被轉(zhuǎn)移的 RNA是被保護(hù)的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護(hù)層 ,但核酶也可以由兩個 RNA分子組成。 RNAi） 是一種由雙鏈 RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。錄RNA， siRNA）目 由于 n 萊 納 (LeschNyhan)綜合征 錄?基因干預(yù)技術(shù)：通過基因干預(yù)，抑制腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)的癌基因，從而降低其惡性表型。目 臨床上對腫瘤患者進(jìn)行化療時，通常面臨兩大難題：（ 1）患者機體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感程度存在差異，特別是某些經(jīng)過多次化療的患者，其體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生了多藥耐藥性，對多種化療藥物產(chǎn)生交叉耐受，最終導(dǎo)致化療失敗。提高化療效果的輔助基因治療目 腫瘤細(xì)胞耐藥性與多種糖蛋白或酶：P450）、 谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶（ GST） 以及谷胱甘肽過氧化物酶（ GSHPX）等。病毒感染人體后不僅可能急性發(fā)病，還可以在人體內(nèi)長期潛伏，造成終身傷害。錄：根據(jù)病毒在機體細(xì)胞中復(fù)制周期的各個環(huán)節(jié)來設(shè)計的（ 1）抑制病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合：即阻斷病毒表面抗原決定簇與宿主細(xì)胞受體間的特異性結(jié)合。錄目 錄謝謝！目 三月 211:18 下午 三月 2113:18March 22, 20231行動出成果，工作出財富。 22 三月 20231:18:59 下午 13:18:59三月 211楚塞三湘接，荊門九派通。勝人者有力，自勝者強。 22 三月 20231:18:59 下午 13:18:59三月 211最具挑戰(zhàn)性的挑戰(zhàn)莫過于提升自我。 2023/3/22 13:18:5913:18:5922 March 20231空山新雨后，天氣晚來秋。 1:18:59 下午 1:18 下午 13:18:59三月 21沒有失敗，只有暫時停止成功！。 三月 21三月 21Monday, March 22, 2023雨中黃葉樹，燈下白頭人。→539。 （ 3）抑制病毒基因組的復(fù)制和蛋白質(zhì)合成。它與某些癌癥、自身免疫性疾病和內(nèi)分泌疾病也存在一定的關(guān)聯(lián)。耐藥基因治療： 抗原抗體基因治療。?腫瘤的免疫基因治療：激發(fā)機體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細(xì)胞功能。n 囊性纖維化病 siRNA的產(chǎn)生目 目 有義 RNA（ sense錄目 錄核酶的作用機制 目 核酶是通過靶 RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)域，要從靶分子和核酶分子兩個方面來設(shè)計核酶。只要兩個 RNA分子通過互補序列相結(jié)合，形成錘頭狀的二級結(jié)構(gòu)（ 3個螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（ 13個或 11個保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應(yīng)。（ 4）能直接作用于一些 RNA病毒目 借助前述的受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法 ， 可以實現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義 RNA轉(zhuǎn)移。RNA） n 將促進(jìn)心臟血管生長的基因直接注入實驗鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細(xì)血管增加 30% ～ 40% ；n 將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細(xì)胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素；n 肌內(nèi)注射凝血因子 Ⅸ 基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子 Ⅸ （ 2）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。錄錄AAV的特點l 以潛伏感染為主；l 病毒基因組與細(xì)胞共存；l 只要宿主細(xì)胞正常， AAV基因表達(dá)被抑制而維持潛伏狀態(tài)；l 若細(xì)胞受刺激，表達(dá)應(yīng)激基因， AAV基因表達(dá)從而使 AAV病毒復(fù)制；l 產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新的細(xì)胞，建立新的潛伏狀態(tài)。錄目 錄Structurel 有兩個環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒。錄目 它通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。目 目 錄反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)l 在 U3內(nèi)有增強子和啟動子； 目 transfer)技術(shù) 定義 :virus,n 應(yīng)用： 是惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。定義 : 通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身 不表達(dá)的基因。 目 錄 （一）基因置換 （ gene目 錄目 DNA指紋技術(shù)是從基因水平檢測 DNA的高度多態(tài)性，個體識別率高。1985年，英國遺傳學(xué)家Jeffeys等人用 TR的核心序列為探針進(jìn)行 RFLP分析時，檢測到許多HVR，并產(chǎn)生相應(yīng)的圖譜，所得圖譜具有高度的個體特異性，達(dá)到了如同人類指紋那樣的高度專一性，所以稱其為DNA指紋圖譜（ DNAfragment人類染色體上小衛(wèi)星 DNA的高度可變區(qū)（HVR）是由頭尾相連的串聯(lián)重復(fù)序列（tandemn 重復(fù)單位 6～ 25（ 2）異源雙鏈 PCR法： 檢測 APC基因變異。polyposis錄（ 1） PCR法檢測 BRCA1基因突變（ 2）熒光原位雜交（ FISH）檢測 BRCA2基因擴增2．乳腺癌基因診斷方法目 錄目 2. ras原癌基因突變常用的檢測方法目 及 PCRSSCP分析： 擴增 ras 基因第12位密碼子點突變部位，再用 SSCP技術(shù)進(jìn)行分析，或者直接測序確定患者 ras原癌基因的點突變。目 基因家族由 Hras、