基因工程原理(完整版)

　　

【正文】 細胞或組織作為生物反應器，直接生產有用蛋白質輕工與食品轉基因植物 ：抗病蟲害新品種、抗逆新品種、 生物制藥；基因治療；人工器官農業和畜牧業傳統的發酵工程主要用于微生物。在體外，將帶有目的基因的外源 DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組 DNA分子。cloning)。目的基因的表達第一節 基因工程的概念及其主要內容一、基因工程的概念：第六章 基因工程原理第一節 基因操作 (gene將重組 DNA分子轉移到適當的受體細胞 (亦稱寄主細胞 )，并與之一起增殖。蛋白質組分析酶工程的概念是酶學與工程學的相互滲透和結合所發展起來以酶為研究對象，改造并應用酶的特異催化功能。現代生物技術還包括動物、植物細胞和工程菌的發酵培養。高品質新品種 轉基因動物 ：生產有用蛋白質和高品質的畜產品 /mg美國生物技術產業發展情況 美國生物制藥產品種類及數量（ PHRAM）疾病種類 呼吸系統疾病 13消化系統疾病 11血液疾病 7不育癥 3生長發育不良癥 2妊娠預防 175中藥臨床藥效 的科學評價與分析方法生物技術的應用核酸酶 — 用 于 DNA和 RNA的非特異性切割 forII型 ： 限制與修飾基因產物獨立起作用，在 Ｅ . coli中這兩種基因位于質粒上。2.(Ⅱ )（三）、限制酶的特點NI外側，產生５ ’端突起3’C４）切點大多數在識別順序之內，也有例外EcoRI5’GOHPAATTC3’3’GGGCCC5’5’GGATG(Ｎ )93’5’GGATG(N)93’CCTAC(N)13SacI2.突變分析（ RFLP分析）kD 。GHpaI抑制同種限制酶的活性 ClaI（ ATCGmAT） TaqI（ TCGmA）如： M.一般特點： 3’磷酸酶活性：除去 3’磷酸基后形成 3’OH端，有利于 DNA聚合酶反應， pH3.反應產物： 5’單磷酸核苷和具缺口或 5’端突起的dsDNA，過度反應將導致 DNA降解基因突變 缺失P 539。HO339。 P539。P539。2bHOOH339。A2.切口移位，制備 DNA探針3’5’1.具 3’→5’ 和 5’ →3 ’ 外切酶活性II具 3’→5’ 和 5’ →3 ’ 外切酶活性聚合酶活性， 5’ →3 ’ ,外切酶活性 其切除速度分別為 40和 cpm/μgDNA)。分離自水生棲熱菌，分子量為 94,000，最適反應溫度 75℃ ， 和 PCR 5’3’3’3’1.2.PAGCTT3’5’AHOPAGCTT3’TCGAPOHATTCGAA5’AAGCTT3’TTCGAA5’（二）、質粒的拷貝數與不親和性 質粒的拷貝數 是指某種質粒在一個細菌細胞內的數目。Bolivar ： 進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如 M13mp系列載體，含 T3， T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。?注：前三個特點必不可少 。*當充任第一作用時，最好是選擇性標記基因；當完成第二作用時，目前多采用非選擇性的 — 檢測性標記基因。四環素抗性基因 （ 四環素抗性基因編碼一種 399Chlorophenicol可結合在核糖體 50Kanr等 抗性基因均可使這類抗生素 磷酸化 ，使之不能進入細胞內。這兩個部分可獨立存在， β— 半乳糖苷酶基因的優點 :βLacZ基因的結構與產物pUC18結構 :類型 :終止子翻譯起始區 b.具有較高的拷貝數，經過氯霉素擴增后，每個細胞中可累積 10003000個拷貝，為重組體 DNA的制備提供了極大的方便。重組分子 I 重組分子 Ⅱ (ApsApSpUC18和 pUC19載體利用菌落顏色篩選重組子分子克隆載體的選擇1.DH5αF’ 可供 M13mp系列載體配套使用， M13病毒的感染需要 F’ 的存在3.11,11,下午 20:43:42三月 211比不了得就不比，得不到的就不要。20:43:4220:43:421111,11,下午 20:43:42三月 211楚塞三湘接，荊門九派通。20:43:4220:43:421111,11,20238:43:4220:43:4220:43:4211dolorurnaiaculisfeliseleifendamet,20231一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。 三月 勝人者有力，自勝者強。 20:43:4220:43:4220:433/11/202320231空山新雨后，天氣晚來秋。 三月 三月 21三月 2120:43:4220:43:42March 20:43:4220:43:4220:433/11/202320231做前，能夠環視四周；做時，你只能或者最好沿著以腳為起點的射線向前。 三月 三月 21三月 2120:43:4220:43:42March 20:43:4220:43:4220:433/11/2023不表達，選表達載體 (外源基因必須表達，表達產物必須具備活性 ) ⅱ) 免疫法：與上同，但表達產物不一定具生物活性 ⅲ) 雜交法：各種載體均可2) 目的基因的鑒定 次克隆：選用質粒載體，限制酶譜分析，基因結構分析等 定序：定序載體（ M13mp系列），其他質粒載體（如 pUC系列，pBR322， T3， T7， SP6啟動子載體）3) 基因表達與調控 外源基因可表達 — 普通載體 。實驗對象（ 1）供體：遺傳背景與 DNA特點等，其中包括染色體 DNA大小，基因大小與結構，堿基組成，目的基因的產物特點以及遺傳物質的傳遞方式等。Tcs）BamHI片段 (Tcr)4)不同類型載體中所缺少的部分必須由外源基因提供。信號肽鏈編碼區 轉化單元 宿主細胞轉化d.特點 :上述兩例中的非重組子來源有兩個：特點 :普通型載體LacZβc.為 α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼 145和 lacZα） Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉移酶，使氯霉素 乙酰化，導致乙酰化的氯霉素不能結合在核糖體上。 Apr抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質的酶，可特異地 切割 氨芐青霉素的 β— 內酰胺環，使氨芐青霉素失活。 Tcr） lacZα），絕大多數為后者。標記基因的作用至少有一個復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制。al)因此，作為載體的質粒應該是松弛型的。DNA連接酶的連接反應 (兩種插入方向 ) +第三節 分子克隆的質粒載體 一、質粒的一般生物學特性；二、質粒 DNA的分離與純化；三、質粒載體的構建及類型；四、常用質粒載體舉例；一、質粒的一般生物學特性（一）、質粒 DNA 質粒 是細菌染色體外能夠自主復制的環形雙鏈的 DNA分子。DNA連接酶　　　　　　 或 TCGAPOHA5’3’TT平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多相同或相容粘性末端的連接只連接 ds特點： 3’3’5’3’主要用于 DNA的體外擴增，經 25次循環后才進入酶的反應穩定期，一個 DNA用途：無 dNTPDNA末端修飾 缺失5’ →3 ’ 聚合酶活性， 15001.和 3)常用大片段（二）、 polIK)3’DNaseI與Pol用途, HOOH339。ExoIII c3P539。HOOH339。P339。在一定條件下， ExoIII不能作用 GC富集區 (來自于 cDNA加尾 )dsDNA結構 :外切酶活性特點dsDNA， pHkD