基因工程原理-資料下載頁

　　

【正文】 錄 翻譯 αβLacZ基因的結構與產物pUC18BamHI片段重組 DNA分子 轉化 外源 DNA BamHI片段 涂布在含 XGal和 Ap的平板上 ,白色菌落為重組子， 蘭色菌落 為原載體利用 LacZ基因篩選重組子（四）、質粒載體的類型根據載體的分子生物學特性劃分 （ 1） . 質粒型載體 — 環狀 dsDNA分子，自主復制 （ 2） . 病毒型載體 — 環狀、線狀、 ss和 dsDNA分子，形成病毒顆粒 （ 3） .混合型載體 — 具質粒和病毒特性，特性的轉換依賴于宿主細胞生物學特性 根據載體功能劃分（ 1） .普通型載體1)特點 :至少有一個以上的克隆位點和兩個標記基因，其中一 個用于轉化體選擇，另一個用于重組子檢測。2)用途 :基因組或 cDNA文庫的構建 。次克隆 (subcloning)或限制酶譜分析；外源 DNA擴增。例子 :pBR322和 pUC載體。上述兩例中的非重組子來源有兩個：a.酶切反應時仍未被作用的 pBR322或 pUC18分子 b. 酶切后的載體分子經自我連接又形成載體分子普通型載體 pBR322的結構圖pUC18和 pUC19載體（ 2）、表達型載體（ expressionvector）1)特點 :a.基因的啟動子序列和終止子序列；b.一般無檢測標記基因；c.克隆位點是確定的（即位于啟動子序列后）；d.重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。2)結構 :a.轉化單元 宿主細胞轉化b.表達單元 外源基因表達3)類型 :Ⅰ 型 ：轉錄起始區（調控序列 +啟動子） +終止子Ⅱ 型 :轉錄起始區終止子 +翻譯起始區（核糖體結合序列和起始密碼子） +終止子Ⅲ 型 :轉錄起始區 +翻譯起始區 +信號肽鏈編碼區 +終止子（常稱之為表達分泌型載體）三種表達型載體結構圖顯然 ,不同類型載體中所缺少的部分必須由外源基因提供。換言之 ,被表達的外源基因一旦確定 ,表達載體的類型也就確定了。4)用途 :a.表達外源基因以產生大量外源基因產物b.用于構建 cDNA文庫 四、常用質粒載體舉例 pBR322載體 pUC載體 pBR322載體優點：分子量較小，為 4363bp，不僅利于自身 DNA的純化，可容納的外源 DNA也較大。具有兩種抗菌素抗性基因可供轉化子的選擇記號。具有較高的拷貝數，經過氯霉素擴增后，每個細胞中可累積 10003000個拷貝，為重組體 DNA的制備提供了極大的方便。BamHI片段 (Tcr)pBR322PstI(Apr)片段 重組分子 I 重組分子 Ⅱ (ApsTcr)(AprTcs）PstI片段 外源 DNABamHI片段重組分子 I涂布 Ap平板 Apr轉化子 分別轉化 (ApSTcS)重組分子 Ⅱ 涂布 Tc平板 Tcr轉化子影印到 Tc平板上 AprTcS為重組子AprTcr為原載體 影印到 Ap平板上 ApSTcr為重組子 即為非重組子利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程篩選重組子的示意圖 pUC18和 pUC19 pUC系列質粒載體具有三個顯著特點： （ 1）、分子量更小，僅為 ，容納外源 DNA量增大；具有更高的拷貝數（不用氯霉素擴增，每個細胞含 500700個拷貝）。 （ 2）、含易于檢測是否有外源 DNA插入的標記基因 LacZα ，可利用 ?互補原理進行藍白篩選。 （ 3）、多克隆位點區（ MCS） 由人工合成的多個單一酶切位點構成。每一種限制性內切酶會產生不同的粘性末端，可選用兩種內切酶組合在質粒載體和外源 DNA上產生相同的末端，進行雙粘端連接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。 其 MCS區與 M13mp噬菌體載體的相同，可使 pUC上克隆的目的基因直接轉移到 M13mp載體，進行 DNA測序和體外突變等研究。pUC18和 pUC19載體利用菌落顏色篩選重組子分子克隆載體的選擇1.選擇克隆載體的幾個重要參數（ 1）實驗對象 （ 2）實驗性質（ 3）載體容量（ 4）合適克隆位點（ 5）載體的穩定性（ 6）載體 DNA制備的難易（ 7）外源基因表達產物產量、產物特點等2.實驗對象（ 1）供體：遺傳背景與 DNA特點等，其中包括染色體 DNA大小，基因大小與結構，堿基組成，目的基因的產物特點以及遺傳物質的傳遞方式等。（ 2）受體：各種中間宿主與終宿主的遺傳背景，如遺傳物質的傳遞方式 (包括人為的方法 )， DNA限制修飾系統， DNA重組基因特點，基因產物修飾系統，即轉錄與翻譯后修飾系統。如常用于基因工程的宿主菌 ，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。如： DH DH5α 、 E .coliDH5αF’ 1） 三者均有限制 修飾系統和重組基因缺陷，外源 DNA可存活，且不發生重組2） DH5α 和 DH5αF’ 都具有一個可供遺傳標記 lacZα 檢測的遺傳背景3） DH5αF’ 可供 M13mp系列載體配套使用， M13病毒的感染需要 F’ 的存在3.實驗性質分子克隆的一般程序包括以下幾步： （ 1）分離供體 DNA或 RNA（ mRNA）和載體 DNA （ 2）構建基因文庫或 cDNA文庫 （ 3）目的基因或 cDNA 克隆的篩選 （ 4）目的基因或 cDNA片段的鑒定：限制酶譜，次克隆，核苷酸序列分析，基因結構分析等 （ 5）基因表達與調控機理的研究1) 建立文庫用載體 常在 進行 小 — 質粒載體，操作方便，鑒定簡單 大 —λ 或 cos質粒載體 , 甚至 pYAC載體 (為減少文庫規模，即使基因組小的也可用 λ 和 cos載體） ⅰ) 互補法：可表達 ,選一般載體 。不表達，選表達載體 (外源基因必須表達，表達產物必須具備活性 ) ⅱ) 免疫法：與上同，但表達產物不一定具生物活性 ⅲ) 雜交法：各種載體均可2) 目的基因的鑒定 次克隆：選用質粒載體，限制酶譜分析，基因結構分析等 定序：定序載體（ M13mp系列），其他質粒載體（如 pUC系列，pBR322， T3， T7， SP6啟動子載體）3) 基因表達與調控 外源基因可表達 — 普通載體 。 不表達 — 表達型（分泌）載體 4. 載體容量 M13mp載體 4 kb 細菌質粒載體 10kb λ 載體 23kb cos質粒載體 48kb P1載體 95 kb pYAC載體 ∽1000 kb5. 合適的克隆位點 單克隆位點和多克隆位點靜夜四無鄰，荒居舊業貧。 三月 21三月 21Thursday,March11,2023雨中黃葉樹，燈下白頭人。 20:43:4220:43:4220:433/11/20238:43:42PM1以我獨沈久，愧君相見頻。 三月 2120:43:4220:43Mar2111Mar211故人江海別，幾度隔山川。 20:43:4220:43:4220:43Thursday,March11,20231乍見翻疑夢，相悲各問年。 三月 21三月 2120:43:4220:43:42March11,20231他鄉生白發，舊國見青山。 11三月 20238:43:42下午 20:43:42三月 211比不了得就不比，得不到的就不要。 。 三月 218:43下午 三月 2120:43March11,20231行動出成果，工作出財富。 2023/3/1120:43:4220:43:4211March20231做前，能夠環視四周；做時，你只能或者最好沿著以腳為起點的射線向前。 8:43:42下午 8:43下午 20:43:42三月 21沒有失敗，只有暫時停止成功！。 三月 21三月 21Thursday,March11,2023很多事情努力了未必有結果，但是不努力卻什么改變也沒有。 20:43:4220:43:4220:433/11/20238:43:42PM1成功就是日復一日那一點點小小努力的積累。 三月 2120:43:4220:43Mar2111Mar211世間成事，不求其絕對圓滿，留一份不足，可得無限完美。 20:43:4220:43:4220:43Thursday,March11,20231不知香積寺，數里入云峰。 三月 21三月 2120:43:4220:43:42March11,20231意志堅強的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 11三月 20238:43:42下午 20:43:42三月 211楚塞三湘接，荊門九派通。 。 三月 218:43下午 三月 2120:43March11,20231少年十五二十時，步行奪得胡馬騎。 2023/3/1120:43:4220:43:4211March20231空山新雨后，天氣晚來秋。 8:43:42下午 8:43下午 20:43:42三月 21楊柳散和風，青山澹吾慮。 三月 21三月 21Thursday,March11,2023閱讀一切好書如同和過去最杰出的人談話。 20:43:4220:43:4220:433/11/20238:43:42PM1越是沒有本領的就越加自命不凡。 三月 2120:43:4220:43Mar2111Mar211越是無能的人，越喜歡挑剔別人的錯兒。 20:43:4220:43:4220:43Thursday,March11,20231知人者智，自知者明。勝人者有力，自勝者強。 三月 21三月 2120:43:4220:43:42March11,20231意志堅強的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 11三月 20238:43:42下午 20:43:42三月 211最具挑戰性的挑戰莫過于提升自我。 三月 218:43下午 三月 2120:43March11,20231業余生活要有意義，不要越軌。 2023/3/1120:43:4220:43:4211March20231一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。 8:43:42下午 8:43下午 20:43:42三月 21MOMODAPOWERPOINTLoremipsumdolorsitamet,consecteturadipiscingelit.Fusceidurnablandit,eleifendnullaac,fringillapurus.Nullaiaculistemporfelisutcursus.感謝您的下載觀看專 家告