生物制品生產(chǎn)和檢定用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程(專業(yè)版)

　　

【正文】 陽性對照應(yīng)為陽性，且吸光度值應(yīng)不低于 。 （ 7）封閉液 3%牛血清白蛋白或 %酪蛋白溶液。 1 代范圍內(nèi)） 。從外面新引入猴群應(yīng)作結(jié)核菌素試驗及猴皰疹 I 型病毒 (B 病毒 )的檢查。對于每個制品生產(chǎn)用細胞每年應(yīng)至少進行一次該項檢定。 每次染色體檢查，應(yīng)至少隨機取 1000 個分裂中期細胞，進行染色體數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)檢查，并作記錄以備復(fù)查。生產(chǎn)用細胞齡限制在細胞壽命期限的前 2/3 內(nèi)。 在某些情況下，用于人體細胞治療及基因治療的細胞也須進行致瘤性檢查。根據(jù)待檢細胞的種屬來 源，須使用不同的敏感細胞進行感染性試驗。 若待檢細胞已知可支持人巨細胞病毒 (CMV)的生長，則應(yīng)在接種人二倍體細胞后至少觀察 28 天，應(yīng)無細胞病變。 3．支原體檢查 取細胞培養(yǎng)上清液樣品，依法檢查， 應(yīng)符合要求（附錄 XII B 進行），應(yīng)為陰性。 凍存前細胞活力應(yīng)在 90%以上，復(fù)蘇后細胞存活率應(yīng)不低于 85%。 3．建立細胞庫 細胞庫為三級管理，即原始細胞庫、主細胞庫及工作細胞庫。 動物來源的細胞系 /株須具有動物種屬、種系、飼養(yǎng)條件、組織或器官來源、地域來源、 年齡、性別、病原體檢測結(jié)果及供體的一般生理狀況的相關(guān)資料。 （一）細胞系 /株歷史資料的要求 1. 細胞系 /株來源資料 應(yīng)具有細胞系 /株來源的相關(guān)資料，如細胞系 /株制備機構(gòu)的名稱，細胞系 /株來源的種屬、年齡、性別和健康狀況的資料。 2．細胞操作的環(huán)境要求 細胞培養(yǎng)的操作應(yīng)符合中國《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求。所制備的 WCB 必須經(jīng)檢定合格（見 本規(guī)程‘ 細胞檢定’中有關(guān)規(guī)定）后，方可用于生產(chǎn)。 可選其中一種或幾種方法，但均須經(jīng)國家藥品檢定機構(gòu)認可。如細胞裂解物對單層細胞有干擾，則應(yīng)排除干擾因素。 ②透射電鏡檢查： 收集待檢細胞，低速離心后，棄上清，沉淀中應(yīng)含有 1107個細胞，且細胞存活率應(yīng)不低于 99%。 某些傳代細胞系已證明在一定代次內(nèi)不具有致癌性，而超過某代次則具有致瘤性，如 VERO 細胞，則必須進行致瘤性檢查。生產(chǎn)用細胞的最高限定代次應(yīng)根據(jù)研究結(jié)果確定，但不得超過國際認可的最高限定代次。對于已建株的人二倍體細胞株，如 WI3 MRC 2BS， KMB17 等，在建立 MCB 時可不必進行細胞染色體檢查。 通常含有活細胞的制品或下游純化工藝不足的制品，應(yīng)對所用細胞培養(yǎng)進行染色體檢查及評價。 2．生產(chǎn)或檢定用猴 多采用非洲綠猴、恒河猴等，我國以恒河猴為主。檢定用細胞的質(zhì)量對檢定結(jié)果的判定具有重要的影響，因此，為保證檢定結(jié)果的有效性、可靠性及真實性，國家藥品檢定檢定機構(gòu)和生物制品生產(chǎn)企業(yè)檢定部門所用的檢定用細胞應(yīng)符合下列要求： （一）細胞資料 檢定用細胞應(yīng)具有明確的合法來源，及相關(guān)的來源證明資料。 (2)供試品保存液 (Ｂ液 ) 每 1L A 液中含 1mg 亮抑蛋白酶肽、 抑胃肽及 1mg 抑蛋白酶肽。以 630nm為參 考波長，于波長 492nm 處測定吸光度。 注意事項 （ 1）如供試品為培養(yǎng)細胞，則將細胞傳代后，培養(yǎng) 34 天長成單層，取上清檢測，取供試品前不得換液。 (2)陽性對照 用 SP2/0 細胞培養(yǎng)上清液作陽性對照，同上處理后，按單次使用量分裝， 70℃ 保存?zhèn)溆谩? （二）細胞檢定 生物制品檢定用細胞應(yīng)至少進行以下 13 項檢定， 根據(jù)檢定用細胞用途的不同， 還應(yīng)按照 4 項下的有關(guān)要求進行相關(guān)的檢定。 1．細胞培養(yǎng) 原材料檢查及細胞培養(yǎng)操作按本規(guī)程 “ 原材料的選擇”及“細胞培養(yǎng)操作的環(huán)境要求”進行。 （ 5） 正常細胞外源病毒因子檢測 制備病毒類制品時，于接種病毒的當天或在連續(xù)傳代的最后一次接種病毒時，留取此批細胞的 5%(或不少于 500ml)的細胞不接種病毒，換維持液作為正常細胞對照。染色體片應(yīng)長期保存，以備復(fù)查。這些細胞可無限傳代，但到一定代次后，致瘤性會增強。 ②新生小鼠 (3~5 日齡 )， 8~10g 小鼠 10 只，在出生后第 0 天、 2 天、 7 天和第 14 天，分別用 抗胸腺血清 (ATS)或球蛋白處理，然后同上每只皮下接種107活細胞。 小鼠來源和其他嚙齒類來源的細胞系或其雜交瘤細胞系有可能攜帶潛在的逆轉(zhuǎn)錄病毒。選用乳鼠、成鼠和雞胚 (兩組不同日齡 )共計 4 組， 按表 2 所列方法進行試驗和觀察。 （ 1）細胞形態(tài)觀察及血吸附試驗 取混合瓶細胞樣品，接種至少 6 個細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，待細胞長成單層后換維持液，持續(xù)培養(yǎng)兩周。非生產(chǎn)用細胞應(yīng)與生產(chǎn)用細胞嚴格分開存放。 （ 1）原始細胞庫 (PCB) 由一個原始細胞群體發(fā)展成傳代穩(wěn)定的細胞群體，或經(jīng)過克隆培養(yǎng)而形成的均一細胞群體，通過檢定證明適用于生物制品生產(chǎn)或檢定。同時還應(yīng)具有細胞鑒別、檢定、內(nèi)源及外源因子檢查 結(jié)果的相關(guān)資料。生產(chǎn)重組制品的細胞基質(zhì)，系指含所需序列的、從單個前體細胞克隆的轉(zhuǎn)染細胞。特別應(yīng)檢測胰蛋白酶來源的動物可能攜帶的病毒，如細小病毒等。每個生產(chǎn)企業(yè)的工作細胞庫必須限定為一個細胞 代次。 表 細胞檢定項目要求 *生產(chǎn)終末細胞 :是指按生產(chǎn)規(guī)模制備的終末代次細胞。每種單層細胞接種至少 107個含有原細胞培養(yǎng)上清液的活細胞懸液或細胞裂解物，每種細胞至少接種 2 瓶。家兔主要用于檢測猴來源細胞中是否存在 B 病毒污染，也可用兔腎細胞培養(yǎng)法代替。在某些情況下，也可能進行轉(zhuǎn)化病毒的檢測，如人乳頭瘤病毒、腺病毒及人單純皰疹病毒。 （四）生產(chǎn)用細胞培養(yǎng) 生產(chǎn)用原材料的選擇和細胞操作環(huán)境應(yīng)符合本規(guī)程‘細胞庫的建立’中有關(guān)規(guī)定。 三、人二倍體細胞株的特殊要求 新建的人二倍體細胞 必須具有以下資料：建立細胞株所用胎兒的胎齡和性別、終止妊娠的原因、所用胎 兒父母的年齡、職業(yè)及健康良好的證明（醫(yī)師出具的健康狀態(tài)良好、無潛在性傳染病和遺傳性疾患等證明），以及胎兒父系及母系三代應(yīng)無明顯遺傳缺陷疾病歷史的書面調(diào)查資料。 4 病毒檢查 二倍體細胞株傳代過程中，至少對 2 個不同世代水平進行病毒包含體、乙型肝炎、丙型肝炎、 EB 病毒，艾滋病病毒進行檢查等，結(jié)果應(yīng)均為陰性。因此，只能嚴格規(guī)范管理和操作措施，以保證以原代細胞為基質(zhì)所生產(chǎn)的制品質(zhì)量。應(yīng)用 Vero 或原代綠猴腎細胞、兔腎細胞檢查