生產(chǎn)菌種的擴大培養(yǎng)與保藏(專業(yè)版)

　　

【正文】 從尾氣中 O2 和 CO2 濃度的含量可以算出產(chǎn)生菌的攝氧率、呼吸商和發(fā)酵罐的供氧能力。它的大 小與氧的傳遞和其它控制參數(shù)有關(guān)。 （ 2）水分的控制 固體發(fā)酵中水份是微生物生長的條件，適當?shù)乃质橇己冒l(fā)酵的重要因素。 固態(tài)發(fā)酵 固態(tài)發(fā)酵主要是一些傳統(tǒng)發(fā)酵工藝。 補料控制參數(shù)的選擇 為了有效地進行中間補料，必須選擇恰當?shù)姆答伩刂茀?shù)，以及了解這些參數(shù)與微生物代謝、菌體生長、基質(zhì)利用以及產(chǎn)物形成之間的關(guān)系。 ?聚醚類：在生 產(chǎn)上應(yīng)用較多的是聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油 (又稱泡敵 )。由此可見，發(fā)酵初期泡沫的高穩(wěn)定性與高的表觀粘度和低表面張力有關(guān)。 培養(yǎng)液中的 CO2 主要作用于細胞膜的脂質(zhì)核心部位； HCO3影響細胞膜的膜蛋白。他們的研究表明，頭孢菌素產(chǎn)生菌的臨界氧濃度在 0~7％的空氣飽和度間；而對卷曲霉素產(chǎn)生菌則為 13~23％。 因此， A/Y 為燃燒生成 1g菌體的底物所需的氧，而 B為燃燒菌體所需氧的量；它們之間的差為C，即為轉(zhuǎn)化底物成菌體所需氧的量。盡管多數(shù)微生物能在 3~4 個 pH 單位的 pH范圍內(nèi)生長，但是在發(fā)酵工藝中，為了達到高生長速率和最佳產(chǎn)物形成，必須使 pH 在很窄的范圍內(nèi)保持恒定。 3，發(fā)酵熱的測定 （ 1）通過測定一定時間內(nèi)冷卻水的流量和冷卻水進出口溫度，由下式求得這段時間內(nèi)的發(fā)酵熱。 用途：合成高能化合物，供微生物生命代謝活動，熱能散發(fā)。s fermentation classification （按照產(chǎn)物生成與菌體生長是否同步） ①生長關(guān)聯(lián)型 (第一類型 ) 形成與生長有關(guān)，如酒精、某些酶等。一般是在一短期內(nèi)失重很快，以后不再變化。在這一過程中，除了氧氣、消泡劑及控制pH 的酸或堿外，不再加入任何其它物質(zhì)。 退化菌種的復(fù)壯 使衰退的菌種重 新恢復(fù)原來的優(yōu)良特性，稱為復(fù)壯。 產(chǎn)腺苷的黃嘌呤缺陷型菌株在接種傳代過程中產(chǎn)量和回復(fù)子數(shù)量間的關(guān)系 實驗 移接代數(shù) 每代斜面保存時間（天） 回復(fù)子比數(shù) 腺苷產(chǎn)量 （ g/L） 1 2 3 4 5 6 0 2 6 7 9 12 147 133， 14 47， 3， 9， 3， 71， 14 47， 3， 9， 3， 13， 58， 14 47， 3， 9， 3， 13， 8， 3， 47， 4 47， 3， 9， 3， 13， 8， 3， 4， 14， 6， 6， 31 1/ 106 1/ 106 1/ 105 1/ 105 1/ 103 1/ 103 由上表可見，雖菌種總的保存時間都是 147 天，但隨著移植代數(shù)的增加，回復(fù)突變率也增加，腺 苷產(chǎn)量下降。在發(fā)酵生產(chǎn)中常用營養(yǎng)缺陷型突變株，如缺 陷型發(fā)生回復(fù)突變就會使產(chǎn)量水平下降。 二、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的衰退與復(fù)壯 微生物具有生命活動能力，其世代時間一般是很短的，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此常常造成工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化，并有可能使優(yōu)良菌種丟失，所以，如何保持菌種優(yōu)良性狀的穩(wěn)定是研究菌種保藏的重要課題。其缺點是菌種仍有一定強度的代謝活動條件，保存時間不長，而且傳代多，因此菌種客易產(chǎn)生變異。 (1)培養(yǎng)基組成 葡萄糖 %，尿素 %，硫酸鎂 %，磷酸氫二鉀 %，玉米漿 ~%(按質(zhì)增減 )，硫酸亞鐵、硫酸錳各 2ppm， 。如嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶， 12 小時最好（見下圖）。 解決措施： 孢子培養(yǎng)的時間應(yīng)該控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。例如在四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對孢子質(zhì)量的影響也不同。培養(yǎng)時間為 5~14 天。因此，種子擴大培養(yǎng)應(yīng)根據(jù)菌種的生理特性，選擇合適的培養(yǎng)條件來獲得代謝旺盛、數(shù)量足夠的種子。 發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過程中的種子的必須滿足以下條件： （ 1）菌種細胞的生長活力強，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短； （ 2）生理形狀穩(wěn)定； （ 3）菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求； （ 4）無雜菌污染； （ 5）保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。將保存的酵母菌種接入含 10ml麥芽汁的 5001000ml三角瓶中，再于 25℃培養(yǎng) 23 天后，再擴大至含有 250500ml麥芽汁的 5001000ml三角瓶中，再于 25℃培養(yǎng) 2天后，移種至含有 510L 麥芽汁的卡氏培養(yǎng)罐中，于 1520℃培養(yǎng) 35 天即可作 100L 麥芽汁的發(fā)酵罐種子。 菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在 6℃冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低 18%，冷藏 3 個月后降低 35%。 通 常接種量，細菌 1~5%，酵母菌 5~10%，霉菌 7~15%，有時 20~25% 三、種子質(zhì)量的控制措施 種子質(zhì)量的最終指標是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。種子罐容積大小取決于發(fā)酵罐大小和種量比例。本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息。但菌種的真正退化必須與由于環(huán)境原因變化而引起菌種形態(tài)、和生理上的變異區(qū)別開來。在菌種篩選工作中經(jīng)常遇到初篩搖瓶產(chǎn)量很高，復(fù)篩產(chǎn)量逐漸下降而被淘汰的現(xiàn)象，在霉菌中更為常見。因此應(yīng)該盡量避免不必要的接種和傳代，把傳代次數(shù)控制在最低水平，以降低突變機率。 第八章 發(fā)酵過程 發(fā)酵過程即細胞的生物反應(yīng) 過程，是指由生長繁殖的細胞所引起的生物反應(yīng)過程。 分批發(fā)酵的生長曲線 單細胞微生物的生長曲線 （ 2）絲狀真菌的生長曲線 在液體振蕩培養(yǎng) (或深層通氣培養(yǎng) )中， 以菌絲干重作為衡量生長的指標，可獲得如圖所示的生長曲線。多數(shù)次生物質(zhì)，如抗生素等，也是在此時合成的。 補料分批發(fā)酵的優(yōu)缺點 優(yōu)點： 使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度； 和連續(xù)發(fā)酵比、不需要嚴格的無菌條件； 不會產(chǎn)生菌種老化和變異等問題。 實驗發(fā)現(xiàn)抗生素高產(chǎn)量批號的生物熱高于低產(chǎn)量批號的生物熱。在溫度達 35℃則只產(chǎn)生四環(huán)素而金霉素合成幾乎停止。應(yīng)按發(fā)酵過程的不同階段分別控制不同的 pH 范圍。 臨界氧濃度（ C 臨）：指不影響菌體呼吸所允許的最低氧濃度，或微生物對發(fā)酵液中溶解氧濃度的最低要求。 發(fā)酵后期由于菌體衰老，呼吸減弱，溶氧濃度也會逐步上升，一旦菌體自溶，溶氧就會明顯地上升。泡沫間被一層液膜隔開而彼此不相連通。 方法：罐內(nèi)消沫法；罐外消沫法。 選擇消泡劑的依據(jù) ?對發(fā)酵過程無毒，對人、畜無害和不影響酶的生物合成。可將補科速率控制在與基質(zhì)消耗速 率相等的狀態(tài)。當采用 20~30℃低溫時，糖化酶作用緩慢，故糖化時間要延長。 在發(fā)酵過程中對 pH、溫度進行連續(xù)控制，中間分析也與通風(fēng)發(fā)酵相似。 7，濁度 能及時反映單細胞生長狀況。 四、間接參數(shù) 根據(jù)發(fā)酵液的菌體量和單位 時間的菌濃、溶氧濃度、基質(zhì)濃度和產(chǎn)物濃度等參數(shù)的變化值，可分別計算出菌體的比生長速率、氧的比消耗速率、基質(zhì)的比消耗速率和產(chǎn)物比生產(chǎn)速率。利用 DO 濃度的變化，可以了解微生物對氧利用的規(guī)律，反映發(fā)酵的異常情況，是一個重要的控制參數(shù)。 3，攪拌轉(zhuǎn)速 是指 攪拌器在發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)動速度。 固體發(fā)酵的 pH 控制 一般工廠用酸度表示。 連續(xù)補料和分批補料發(fā)酵的比較 補 料速率的確定 優(yōu)化補料速率也是補料控制中十分重要的一環(huán)，因為養(yǎng)分和前體需要維持適當?shù)臐舛龋鼈儎t以不同的速率被消耗，所以補料速率要根據(jù)微生物對營養(yǎng)等的消耗速率及所設(shè)定的培養(yǎng)液中最低維持濃度而定。 六、補料控制 1，基質(zhì)濃度對發(fā)酵的影響 2，補料控制目的 在發(fā)酵過程中采用不料控制的工藝主要是為解決以下問題： （ 1）解除基質(zhì)過濃的抑制； （ 2）解除產(chǎn)物的反饋抑制； （ 3）解除葡萄糖分解代謝阻遏效應(yīng)。 ?不影響以后的提取過程。泡沫與液體間沒有明顯的波面界限，在鼓泡的發(fā)酵液中氣體分散相占的比例由下而上地逐漸增加。例如，發(fā)酵液中 CO2的濃度達到 101mol，就會嚴重抑制酵母的生長；當進氣口 CO2的含量占混合氣體的 80%時，酵母活力與對照相比降低 20%。研究表明：菌體的臨界溶氧濃度為 ；并根據(jù) ―安全 ‖的程度予以考慮供氧的程度，也即把菌體的呼吸率作為最大呼吸率的一個組成部分。許多研究工作者已經(jīng)考慮到氧、碳源、氮源轉(zhuǎn)化為生物物質(zhì)的總化學(xué)計量關(guān)系，并利用這樣的關(guān)系來預(yù)測發(fā)酵的需氧情況。 最適發(fā)酵溫度的選擇：在發(fā)酵的整個周期內(nèi)僅選一個最適培養(yǎng)溫度不一定好。 攪拌熱的計算： Q 攪拌 =3600（ P/V） 式中 3600：熱功當量（ kJ/（ ）） 抗生素相對活性為 1 抗生素相對活性為 （ P/V）：通氣條件下單位體積發(fā)酵液所消耗的功率（ kW/m3） （ 3）蒸發(fā)熱 定義：通入發(fā)酵罐的空氣，其溫度和濕度隨季節(jié)及控制條件的不同而有所變化。 一、溫度對發(fā)酵的影響及控制 1，影響發(fā)酵溫度的因素 （ 1）產(chǎn)熱因素：生物熱和攪拌熱。 其動力學(xué)方程為： ②第二類型（部分生長關(guān)聯(lián)型） 產(chǎn)物也來源于能量代謝所消耗的基質(zhì)，但產(chǎn)物的形成在與初級代謝分開的次級代謝中，出現(xiàn)兩個峰，菌體生長進入穩(wěn)定期，出現(xiàn)產(chǎn)物形成高峰（見下圖）。因為真菌不是單細胞，其繁殖不以幾何倍數(shù)增加，故而沒有對數(shù)生長期。 了解生產(chǎn)菌種在具有合適的培養(yǎng)基、 pH、溫度和通氣攪拌等環(huán)境條件下對基質(zhì)的利用、細胞的生長以及產(chǎn)物合成的代謝變化，有利于人們對生產(chǎn)的控制。而孢子一般是單核的，利用孢子來接種，可以達到防止衰退的目的。通過實驗得到下表所示數(shù)據(jù)。一般菌種退化是從量變到質(zhì)變逐漸發(fā)生的，同時也是整個群體中產(chǎn)量降低及其相聯(lián)系的種種特性的變化，而不是指單個細胞的改變。該法存活率高，變異率低，并能廣泛適用于細菌 （ 有芽孢和無芽孢的 ） 、酵母、霉菌孢子、放線菌孢子和病毒等，因此是目前廣泛采用的好方法。 菌種保藏的原理 菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。 4，酶活力 種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián)。但也有例外，例如土霉素生產(chǎn)菌，一級種子罐的通氣量小對發(fā)酵有利。例如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌，孢子制備時發(fā)現(xiàn)：在北方氣候干燥地區(qū)孢子斜面長得較快，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。 茄子瓶→種 子罐→發(fā)酵罐 霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵 孢子懸浮液→一級種子罐（ 27℃ ,40 小時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲 ）→二級種子罐（ 27℃， 10~24小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐 放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵 酵母：比細菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子 3，確定種子罐級數(shù)需注意的問題 （ 1）種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會 （ 2）種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機會 （ 3）雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。 2，霉菌孢子的制備 霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。第七章 生產(chǎn)菌種的擴大培養(yǎng)與保藏 目前工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵罐容積已達到幾十立方米或幾百立方米。 細菌菌體培養(yǎng)時間一般為 1~2 天，產(chǎn)芽孢的細菌培養(yǎng)則需要 5~10 天。 比如： 細菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。 （ 2）濕度 制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。例如，青霉素的生產(chǎn)菌種在制備過程中將通氣充足和不足兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差 1 倍。 3，產(chǎn)物生成量 在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標，因為種子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。其任務(wù)首先是使菌種不致死亡，同時還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。 微生物在此條件下易死亡，所以需加入一些物質(zhì)作保護劑，一般常用的是脫脂牛奶、血清等。因此，必須正確判斷是否退化，才能找出正確的解決辦法。為了得到較多純種，有人考慮提高誘變劑量，使單核細胞 DNA 雙鏈中一條鏈的某一點發(fā)生突變 ，另一條鏈完全失活不再復(fù)制來提高純菌產(chǎn)生率。 （ 3）利用不同類型的細胞進行傳 代 在放線菌和霉菌中，由于它們的菌絲細胞常含有許多核，甚至是異核體，因此用菌絲接種時就會出現(xiàn)衰退和不純的子代。 第一節(jié) 發(fā)酵過程的代謝變化規(guī)律 代謝變化就是反映發(fā)酵過程中菌體的生長，發(fā)酵參數(shù)（培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件等）和產(chǎn)物形成速率三者間的