發酵生物化學基礎(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 轉為 ATP 3，磷酸烯醇式丙酮酸羧基轉磷酸化酶：它所催化的反應與②相同，但需要二碳酸和無機磷酸，后者本身能變成焦磷酸． 4，丙酮酸羧化酶： 它催化丙酮酸羧化成草酰乙酸，并使 ATP 轉化成 ADP 和 Pi，反應中還需要生物素。 5，蘋果酸酶：它催化丙酮酸還原羧化成蘋果酸，以 NAD(P)H2 為供氫體。 6，異檸檬酸脫氫酶：它催化 α酮戊二酸還原羧化成異檸檬酸，需要 NAD(P)H2。 毫無疑問，以上六種酶，并不同時存在于一個有機體中，例如腸桿菌科中就以磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶為主，催化固定 CO2的反應。三羧酸循環的中間產物的消耗 (用于生物合成 )，可由這些固定作用加以補充。以上固定 CO2 的途徑可歸納如圖 6— l0。 此外，在脂肪酸合成 中也有固定 CO2 的反應，如乙酰 CoA 在乙酰 CoA 羧化酶的催化下生成丙二酰 CoA，此反應得要生物素和 ATP。 在核苷酸合成中也有固定 CO2 的反應，如嘌呤核苷酸合成中， 5氨基咪唑核糖 5磷酸與 CO2反應，生成 5氨基 4羧基咪唑核糖 5 磷酸。還有 CO2 和 NH3在氨甲酰磷酸合成酶催化下，生成氨甲酰磷酸，作為合成 UMP 的起始物或參與瓜氨酸的合成。 異養型固定 CO2 的方式，在許多微生物中都有，甚至某些自養的光合細菌也有此種反應方式。這種固定 CO2方式的特點是 CO2 被固定在某種有機物 (主 要是有機酸 )中，結果是加長了碳鏈，使來自 CO2的碳原子也可用于某些物質的生物合成。 第七節 微生物的光合作用 光合作用是自然界一個極其重要的生物學過程，除高等植物外，還有光合微生物，如藻類、藍細菌和光合細菌 (包括紫色細菌、綠色細菌、嗜鹽菌等 )。在植物、藻類和藍細菌的光合作用中，還原 CO2 的電子是來自水的光解，并有氧的釋放。把這類光合作用稱為放氧型光合作用。在光合細菌中，光合作用還原 CO 2 的電子是來自還原型無機硫、氫或有機物，沒有氧的釋放，把這種類型的光合作用稱為非放氧型光合作用。 光合作用的本質是指生物 (包括植物、藻類和光合細菌 )將光能轉變為化學能，并以穩定形式貯藏的過程。前者是指光化反應階段，后者是指暗反應階段。現分別介紹幾種光合細菌的能量轉化。 紫色細菌的光能轉化 紫色細菌的光能電子傳遞見下圖。 紫色細菌的光能點子傳遞途徑 從圖中可知，紫色細菌是以環式電子傳遞方式進行的。其過程可分為五步：（ 1）光的吸收，紫色細菌通過光捕獲復合體 (Bchl 十類胡蘿卜素十 B870)；（ 2）使反應中心葉綠素 (P870)處于激發態 (P*870)；（ 3）電荷分離， P*870 失去一個電子為 P+870，高能電子躍升到電子受體細 菌脫鎂葉綠素 (Bph)形成 Bph；（ 4）電子沿醌鐵蛋白 (QFe)， Q 細胞色素 b 到 C 2 順序移動，電子在細胞色素 b 至 C2 時偶聯磷酸化產生 ATP；（ 5）低能電子返回到 P+870 形成 P870，然后整個系統又接受光量子重復上述過程。 紫色細菌在生物合成中需要 NAD(P)H。當其在氫中生長時，可以利用分子氫直接還原NAD(P)+為 NAD(P)H。在異養生長時，各種氧化還原電位較高的基質對 NAD+的還原一般都是由光能推動的。紅螺菌科中醌鐵復合體的氧化還原電位不夠低，不能直接還原 NAD+，它們是通過環式電子傳遞 產生 ΔP，再由 ΔP推動從琥珀酸到 NAD+的電子逆轉，以還原 NAD+為 NADH。 紫色細菌光能轉化的特點是：①紫色細菌能利用長波光， Bchl 吸收光的峰值為 870nm；②紫色細菌是環式電子傳遞方式進行的； ③ 在異養生長時一般不能直接還原 NAD+為NADH。 第四章 培養基及其制備 第一節 原料 一 、 原料的 定義及選擇 （一）原料的定義 從工藝角度來看，凡是能被生物細胞利用并轉化成所需的代謝產物或菌體的物料，都可作為發酵工業生產的原料。 （ 二 ）選擇原料的依據 1，原料選擇的原則 選擇淀粉質原料生產酒精時，從工藝 的角度著眼，凡任何含有可發酵性糖或可變為發酵糖的原料，都可作為酒精生產的原料。對于工業上大規模投入生產的原料，除了要提出工藝上的要求外，還要提出生產管理和經濟上的要求，因此，在選擇工業上大規模生產酒精的原料時，應考慮到下列諸條件： （ 1）因地制宜，就地取材，原料產地離工廠要近，便于運輸，節省費用。 （ 2）要求原料內碳水化合物含量較多，蛋白質含量要適當，適合與微生物的需要和吸收利用。 （ 3）原料資源要豐富，容易收集。由于酒精生產需要大量原料，要保證一定的庫存量。 （ 4）原料要容易貯藏。應考慮到新鮮原料內含水量 多，不耐久藏，最好選擇經，干燥后，含水極少的干原料，易與保藏，不宜霉爛。 （ 5）對人民的身體無尋損害，影響發酵過程的雜質含量因應當極少，或者幾乎不含。 （ 6）原料價格低廉，可降低產品成本。 此外，還應當考慮到大力節約糧食原料，盡量少用或不用糧食原料，充分利用當地的非糧食原料，廣泛利用野生植物原料，同時利用農林副產物和植物纖維原料，以及亞硫酸鹽紙漿廢液等，對于節約糧食原料有著重要意義。另外，利用石油原料化學合成制造酒精，也是發展酒精的主要途徑。 2， 在確定原料選擇原則時需注意的問題 （ 1）所選用的培養基與所使 用的發酵器的結構有關。 例如 ICI 公司因指定用甲醇和氨生產單細胞蛋白質而另行設計新的發酵罐。同樣的理由，在一個巳設定的發酵罐中，發酵必然會受到培養基組份改變的影響。 （ 2）從實驗室規模放大到實驗工廠規模，以至于放大到工業生產規模，都要考慮培養基的組份的變化。 （ 3）培養基的組成，除了考慮到菌體生長和產物的形成的需要外，還要考慮到培養基的 pH 變化、泡沫的形成、氧化還原電位和微生物的形態等，而且還有前體和代謝抑制劑的需要。 二、常用主要原料及其化學組成 （ 一 ）原料的種類 發酵 生產的原料，一般可分成下列幾類： 1， 薯類 ： 甘薯、馬鈴薯、木薯、山藥等。 2， 糧谷類 ： 高粱、玉米、大米、谷子、大麥、小麥、燕麥、黍和稷等。 3， 野生植物 橡子仁、葛根、土茯苓、蕨根、石蒜、金剛頭、香符子等。 4， 農產品加工副產物 米粞、米糠餅、麩皮、高粱糠、淀粉渣等。 （ 二 ） 常用原料的化學組成 原料所含的化學成分，不僅關系著生產率的高低，同時也影響生產的工藝過程。常用原料中主要的化學成分如下： 碳水化學物 ： 原料中所含的淀粉，或與淀粉類似的菊糖、蔗糖、麥芽糖、果糖及葡萄糖等，這些物質都可以發酵生成 產品 ，同時也是霉菌和酵母的營養及能源，原料中含這 些物質越多，生成酒精也就越多，所以它和產量有著密切的關系。碳水化合物中的五碳糖多存在于原料的皮層，如麩皮、高粱糠，谷糠、花生殼等都含有很多，它不但影響淀粉數字偏高，發酵中也易生成有害的糠醛。纖維素雖屬于碳水化合物，但不被淀粉水解，只起填充作用，對于發酵沒有什么直接影響。 蛋白質 ： 原料含有的蛋白質，在 發酵 生產過成中，經蛋白酶水解后，可為 微生物 生長繁殖的重要營養成分，而微生物細胞中， 30~50%（干重）是蛋白質。一般的說，當培養基內氮的含量適當，則 微生物 生長旺盛，酶的含量也較高。有些原料所含蛋白質有時不能滿足微生物生長和繁殖的要求，則應從外界加入氮源。蛋源一般包括有機蛋源和無機氮源兩種，根據不同情況，添加不同種類的氮源。 脂肪 ： 對發酵有影響，如高粱糠、米糠等含油脂多，則生酸較快，生酸幅度也較大。一些 發酵 廠如采用玉米作為原料，總是把玉米坯芽除去。 灰分 ： 灰分中的磷、硫、鎂、鉀、鈣等是構成菌體系胞的和輔霉的重要成分，還有調節滲透壓的作用，是微生物生長不可卻少的，在一般原料中，灰分的含量一足夠。 三、工業發酵培養基的設計 1，為何要進行培養基的設計？ 完善的培養基設計是實驗室的試驗、實驗工廠和生產規模的放大中的一個重 要步驟。在發酵過程中，我們的目的產品是菌體或代謝產物。而發酵培養基是否適合于菌體的生長或積累代謝產物，對最終產品的得率具有非常大的影響。 2，培養基設計的基本原則 培養基的組成必需 滿足 細胞的生長和代謝產物所需的元素，并能 提供 生物合成和細胞維持活力所需要的能量。 3，如何進行培養基的設計 （ 1）作出細胞生長和產物形成的化學計算的平衡 碳源和能源 +氮源 +其他需要→細胞 +產物 +CO2+H2O++熱量 通過計算可以獲得生產一定數量的細胞時所需的營養物的最低數量。在了解一定數量的生物體所能產生的產物數量后；就有可能計 算出形成產物時所需的底物數量。 這些培養基的組份的數量僅僅是供給細胞形成產物，而不包括生成細胞所需的營養。所有上述各項數量，是不易獲得其精確的數字。 （ 2）組成微生物的元素包括 C、 H、 O、 N、 S、 P、 Mg 和 K（見下表），這些元素都要在方程式中予以平衡 細菌、酵母和真菌的元素組成 (按干重％計 ) 在培養基中有些元素的含量往往超過需要量，如 P和 K。而其它元素含量則接近最低值(如 Zn， Cu 等 )。在許多培養基中增加磷酸鹽濃度，其用意是增加培養基的緩沖容量，這一點，在設計培養基時要引起注意。 （ 3）有些微 生物無力的合成特定營養物，如氨基酸、維生素或核苷酸。一旦測出其中一種是生長因子，就要在培養基中加入適量的純凈的化合物或含有該物質的混合物。 （ 4）碳源具有生物合成的底物和能源的雙重作用，在需氧條件下，對碳源的需要量可以從菌體對底物的產率系數 (Yx/s)推算而得。 該系數的定義是：細胞干物質的產量／碳源底物的被利用量 下表中列出了一些 Yx/s 值。如以葡萄糖為底物時，其 Y 值為 即表示每 1g葡萄糖能生成 細胞干物質。為要獲得 30gdm3 濃度的細胞，需要葡萄糖 30／ ＝ 60gdm3。 在發酵過程中，適當地補充碳源是必要的。將碳源轉化成產物的觀察值與理論上最大值之間進行比較，才能進行深入的研究。但由于對生物合成的知識的限制而難以作出精密的分析。 Cooney(1979)以青霉素生物合成的途徑為基礎，通過物質和能量平衡，計算出青霉素生物合成的理論值。總的化學計算式為 方程式中的 a b c d e nz、 p2 和 q2 都是化學計算中的系數， PAA 代表苯乙酸。解方程式．得： 按上述方程式計算每 1g 葡萄糖能產生 芐青霉素的理論值。在青霉素分批發酵的一個簡單模型中，用于合 成細胞、維持生命活力和轉化成青霉素的葡萄糖，分別占總糖耗量的 2 61 和 11％。在分批補料發酵時，則 26％的葡萄糖用于生長、 70％用于維持生命、 6％用于合成青霉素。每克葡萄糖的最大青霉素轉化產量為 ，這個理論值數倍于實驗值。 4，發酵培養基的組成成分 （ 1） 水 （ 2） 碳源 ? 影響選擇碳源的因素 ： ? 原料成本占生產總成本的比例； ? 在某些發酵過程中，必須除去碳源中的雜質； ? 對碳源的選擇，往往還受到政府政策的影響； ? 當地的法律條例指定了許多飲料業所使用的底物； ? 培養基的配制方法，特別是滅菌方法。 （ 3） 氮源 （ 4） 無機鹽 （ 5） 維生素 （ 6） 緩沖劑 控制 pH 時對獲得最佳生產能力是十分重要的。在培養基中加入一種化合物作為緩沖劑或同時可作為營養源。許多種培養基多加入碳酸鈣作為緩沖劑，以達到 pH7． 0 左右。如果pH 下降，則碳酸鈣分解，如果是 pH 上升，可以自然地校正微生物的產酸量。在許多培養基中，也用磷酸鹽作為重要的緩沖劑。 碳源和氮源的平衡，也是控制 pH 的一種方式。在玉米漿中的蛋白質、肽、氨基酸等也具有緩沖容量。滴加氨，氫氧化鈉和硫酸，可以嚴格地控制 pH 值。 （ 7）前體和代謝調節劑 （ 8）消沫劑 OHqCOpnPAAeSOHdOcNHbOHCa 222222422223261262 ??????? 卞青霉素 OHCOSNOHCOHCSOHONHOHC 222418182884222136126610 922 ??????? 第二節 原料處理 一、預處理的必要性 1，發酵工廠在進行生產前，必須先將原料中混雜的小鐵釘、雜草、泥快和石頭等雜質除去，保證后續工序生產的正常和順利進行。 2，為保證后續工序生產的正常和順利進行，還需對原料進行適當加工。 3，為保證生產環境的清潔，必須采用適當的輸送方式將原料從倉庫運送至配料罐或反應器。 二、預處理的方法（方式） （一）原料除雜 1， 篩選、風選 氣流 篩式分離機：這類分離機主要用于谷物原料除雜用。凡是厚度和寬度或空氣動力學性質 (懸浮速度 )與所用谷物不同的雜質，都可用氣流 篩式分離機將其分離。 2，磁力除鐵 包括 永久性磁力除鐵器和電磁除鐵器兩種方式。 （ 二 ）原料的粉碎 1，原料 粉碎的目的 把原料進行粉碎后成為粉末原料，其目的是要增加原料受熱面積，有利于淀粉