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生物制品生產和檢定用動物細胞基質制備及檢定規程(編輯修改稿)

2025-09-25 11:29 本頁面

　

【文章內容簡介】的細胞系 /株，則應檢測如人鼻咽癌病毒、人巨細胞病毒、人逆轉錄病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。在某些情況下，也可能進行轉化病毒的檢測，如人乳頭瘤病毒、腺病毒及人單純皰疹病毒。這些病毒的檢測可采用適當的體外檢測技術。 5 致瘤性檢查某些傳代細胞系已證明具有致瘤性，如來源于嚙齒類的細胞系 BHK21， CHO，C127 細胞等，或細胞類型屬致瘤性細胞，如雜交瘤細胞，則可不必作致瘤性檢查。某些傳代細胞系已證明在一定代次內不具有致癌性，而超過某代次則具有致瘤性，如 VERO 細胞，則必須進行致瘤性檢查。人上皮細胞系、人二倍體細胞株及所有用于活病毒疫苗生產的細胞系 /株應進行致瘤性檢查。另外，新建細胞系 / 株必須進行致瘤性檢查。在某些情況下，用于人體細胞治療及基因治療的細胞也須進行致瘤性檢查。將 MCB 或 WCB 的細胞增殖到或超過生產用體外細胞齡限制代次，再進行致瘤性試驗。” 下述兩種致癌性試驗方法可任選其一： ①裸鼠至少 10 只，將細胞懸浮于適量無血清培養基中，使細胞濃度為 5107個細胞 /ml，每只裸鼠皮下或肌內注射；同時用 Hela 或 Hep2 細胞設立陽性對照，陽性對照組至少 10 只，每只注射含 106個細胞；可用人二倍體細胞株作為陰性對照，陰性對照組至少 10 只，每只注射含 1067個細胞。 ②新生小鼠 (3~5 日齡 )， 8~10g 小鼠 10 只，在出生后第 0 天、 2 天、 7 天和第 14 天，分別用抗胸腺血清 (ATS)或球蛋白處理，然后同上每只皮下接種107活細胞。并設立陽性對照組，對照組至少接種 10 只。結果判定： ① 定期觀察并觸摸注射部位有無結節形成，且形成的任何結節均應進行雙向測量并記錄。 ② 陽性對照組應至少有 9 只有進行性腫瘤生長時，試驗視為有效。 ③ 如試驗組動物有進行性生長的結節或可疑病灶，應觀察至少 1~2 周；若出現的結節在觀察期內開始消退，則應在結節完全消退前，處死動物并進行解剖作病理及組織學檢查。 ④未發生結節的動物半數應觀察 21 天，剖檢，另外半數動物應觀察 12 周，進行病理檢查，剖檢接種部位，觀察各淋巴結和各器官有無結節形成，如有懷疑，進行病理組織檢查，不應有轉移瘤形成。除上述體內法外，也可采用軟瓊脂克隆形成試驗或器官培養試驗等體外法檢測，特別適用于在低代次時在動物體內無致瘤性的傳代細胞系。（四）生產用細胞培養生產用原材料的選擇和細胞操作環境應符合本規程‘細胞庫的建立’中有關規定。從凍存的 WCB 中取出一支或多支安瓿，混合后培養，傳至一定代次后供生產用。其代次不得超過該細胞用于生產的最高限定代次。生產用細胞的最高限定代次應根據研究結果確定，但不得超過國際認可的最高限定代次。從 WCB 取出的細胞種子增殖的細胞不得再回凍保存后而再用于生產。體外培養細胞齡的計算二倍體細胞齡以細胞群體倍增（ Population Doubling）計算，以每個培養容器細胞群體細胞數為基礎，每增加一倍作為一世代，即一瓶細胞傳二瓶 (1:2分種率 )，再長滿瓶為一世代；一瓶傳四瓶 (1:4)為二世代；一瓶傳八瓶 (1:8)則為三世代。生產用細胞齡限制在細胞壽命期限的前 2/3 內。傳代細胞系則以一定稀釋倍數進行傳代，每傳一次為一代。二、連續傳代細胞系的特殊要求傳代細胞系一般是由人或動物腫瘤組織或正常組織傳代或轉化而來，可懸浮培養或采用載體培養，能大規模生產。這些細胞可無限傳代，但到一定代次后，致瘤性會增強。所以對生產用傳代細胞系應進行嚴格檢查。應按本規程‘細胞的檢定’ 的規定進行細胞庫的檢查。對生產過程中細胞培養的要求如下： 1．用于生產的細胞代次用于生產的傳代細胞系，生產代次應有一定限制。用于生物制品生產的細胞最高限定代次，須經批準。 2．生產過程中細胞培養物檢查：對于病毒類制品，在生產末期，應按照本規程中的三 .6（ 2）、（ 3）、（ 4）和（ 5）對生產對照用細胞進行檢查，并合格。對于在不同時間收集合并的培養物，應在每次收集時檢測對照細胞培養物。三、人二倍體細胞株的特殊要求新建的人二倍體細胞必須具有以下資料：建立細胞株所用胎兒的胎齡和性別、終止妊娠的原因、所用胎兒父母的年齡、職業及健康良好的證明（醫師出具的健康狀態良好、無潛在性傳染病和遺傳性疾患等證明），以及胎兒父系及母系三代應無明顯遺傳缺陷疾病歷史的書面調查資料。人二倍體細胞株應在傳代過程的早期，選擇適當世代水平（ 28 世代）增殖出大量細胞，定量分裝后，置液氮中或 – 130℃下凍存，供建立 PCB 之用，待全部檢定合格后，即可正式定為 PCB，供制備 MCB 用。 1．染色體檢查及判定標準新建人二倍體細胞株及其細胞庫必須進行染色體檢查。對于已建株的人二倍體細胞株，如 WI3 MRC 2BS， KMB17 等，在建立 MCB 時可不必進行細胞染色體檢查。但如對細胞進行了遺傳修飾，則須按新建細胞株進行染色體檢查。（ 1）染色體檢查新細胞建株過程中，每 8~12 世代應作一次染色體檢查，一株細胞整個生命期內連續培養過程中，至少應有 4 次染色體檢查結果。每次染色體檢查，應至少隨機取 1000 個分裂中期細胞，進行染色體數目、形態和結構檢查，并作記錄以備復查。其中至少選擇 50 個分裂中期細胞進行顯微照相，作出核型分析，并應粗數 500 個分裂中期細胞，檢查多倍體的發生率。每次染色體檢查，應從同一世代的不同培養瓶中取細胞，混合后進行再培養，制備染色體標本片。染色體片應長期保存，以備復查。可用 G 分帶或 Q 分帶技術檢查 50 個中期細胞染色體帶型，應用照相圖片作出帶型分析。（ 2）判定標準對 1000 個和 500 個中期細胞標本異常率進行檢查，合格的上限 (可信限 90% Poison 法 )如表 2。表 2 人二倍體細胞染色體分析標準檢查細胞數異常 1000 500 100 染色單體和染色體斷裂 47 26 8 結構異常 17 10 2 超二倍體 8 5 2 亞二倍體 * 180 90 18 多倍體 ** 30 17 4 *

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