生物實驗方案word版(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 凍溶解將降低 ATP活性從而影響連接酶的催化作用。 加適量的插入 DNA 序列。 加入適量的宿主載體。 加 μ L ligase . 吸液加樣之前將 ligase 渦旋混勻 . 跟大多數的酶一樣， ligase 就像 glycerol 一樣易沾在加樣器吸頭上，因此吸取的時候為確定你只加了 1 μ L,只需將吸頭放在液體表面吸取即可 . 將這 10 μ L 溶液置 176。 C 孵育 30 min . ligase 65 176。 C 變性 10 min . 電穿孔透析 20 min . Use disks shiny side up 20 176。 C 儲存。 這一儀器用于分析典型的 DNA 連接酶（ kb 質粒載體 + kb 插入的重組 DNA 粘性末端），其分析效果是非常好的。反應條件是：質粒載體 50 ng，按插入 DNA片段與質粒 2:1的摩爾比例，加入標準 T4 ligase， 置 16 176。 C過夜。 Ligase 65176。 C 20 min，然后取 2μ L (20 μ L)用于熱休克活化細胞是轉換 . Ligation efficiency was marginally decreased by ？？？？？？？？？？？ 1 hr 連接酶室溫酶切 100 ng 質粒載體 插入 DNA: 載體的摩爾比例為 5:1 和 1:1 Ligation 效率 noticably 減少 (x100) ............. Ligation 粘性末端有一個比較大 的插入片段 ( kb 質粒 + kb 插入 DNA片段） 平末端的連接 連接效率急劇 下降 (x10000)了 ..... PCR產物延伸階段盡量使用暴露于 ethidium 溴化物和紫外線的 DNA 碎片 ( 困難的避免但是衷心推薦 ) 使用 NEB 快速連接裝備 Notes 確定 buffer 完全融化而且溶解。產生的白色沉淀物是依照 NEB 設定的 BSA。要求所使用的 buffer 味道聞起來像 wet dog( 檢查 DTT 是否完好） 。 由于 ligase buffer 中的 ATP 不穩定，其活性容易隨 著多次冰凍 / 溶解而降低 ,因此你可能需要從最初的tube管吸取 1020 ul ligase 。 Ligase buffer 可以牢牢吸附游離的 ATP。 如果你所使用的 ligation 有問題 ,可以向 NEB FAQ39。s 和 tips 尋求幫助 (Ligation T4 DNA ligase)。 ligation 之前 ,微熱 (37 176。 C左右 ) 可以有效融化那些在比較低的溫度下就可以退火的 DNA粘性末端 . Tom Knight 報道 ， igase 能抑制宿主菌的變形轉換。使用熱鈍化的 ligase，能夠消除這個抑制作用，然 而， 依照 NEB FAQ，熱鈍化的 PEG（存在于酶聯反應中的）也能抑制該變形轉換作用 ,因此如果你在實驗過程中存在上述問題時，建議您在進行轉換之前先進行 spincolumn 純化。 進行限制性酶切之前使用 proteinase K 處理 PCR 產品可以有效提高接下來的酶聯反應 .使用 SYBR Safe DNA Gel Stain 是比較安全，同時也可以有效減少 ethidium 溴化物的致癌作用。 VII DNA 酶切 1 和 10X buffer 2. III. GST 融合蛋白 細菌的生 長和收獲 取 100 ul ampicillin 加入到 100 ml LB 中 ,接種 ,過夜生長 . 早上把過夜的肉湯加入到 900 ml 預溫 LB 中 ,生長一個小時或加 . Ampicillin 助于質粒生長 .如果需要使用甘油過夜培養 ,加入 1 ml IPTG (終濃度為 )到 1L培養液中 ,培養 3~5 小時 ,或在其誘導感應前除去 100 ul 細胞 并加入 100 ul SDSPAGE sample buffer,一過性煮沸 ,取出 10 ul 做 SDSPAGE,數次沖洗 DNA 碎片 ,可獲得較明顯的帶紋 .每 隔一小時收集一次樣品以確定誘導的時間 . 500 ml 離心瓶中加入培養液 ,5K 1039。 ,時其形成塊狀 . 10 ml全懸緩沖液中重懸 .盡可能時病菌保存在冰上 ,使蛋白水解作用降到最低 . 參照 French Press 2x @12,000psi. Add PMSF 溶解細菌 ,如果有必要 ,在壓制前加入 French Press 2x @12,000psi. Add PMSF 溶菌液 ,在 10K 4C 離心 10分鐘，形成塊狀沉淀 .取 ul 上清液制備SDSPAGE,待其凝集 ,取 ul上清液檢查蛋白質是否被充分溶解 . 將菌液轉移到 15 ml 離心管中 ,10K 1039。 4C 離心至細胞碎片沉于離心管底部 ,取上清 , 70176。 C貯存 . BINDING TO BEADS AND THROMBIN CLEAVAGE Incubate soluble lysate with 1/2 volume of 50% GST beads at 4C rocking on the Nutator for 3060 minutes. 50 ml conical Falcon tubes work well. Pour into a BioRad Column and drain lysate. Save 100 ul of depleted lysate. Load ul for SDSPAGE. Wash beads with 3 column volumes resuspension buffer and 1 volume thrombin cleavage buffer. Seal the bottom of the column. Add 1 column volume thrombin cleavage buffer plus thrombin. 10ug per mg fusion protein is a good starting point. Incubate 3060 minutes at room temp rocking on the Nutator. If the protein is subject to degradation, try a 60 minute cleavage at 4C. Drain BioRad columns. Soluble cleaved fusion protein will be in the filtrate. Add a column volume of buffer to rinse out all cleaved protein. Rinse and save labelled tubes for reuse. Save about 20 ul of beads. Load 110 ul for SDSPAGE. Optional: a second thrombin cleavage in 1/2 the previous volume. Inactivate thrombin with AEBSF or PMSF. Concentrate on the Centricon or Cell Stirrer if needed, or freeze as is. Save 100 ul of unconcentrated, purified protein. Load 110 ul for SDSPAGE. Quantitate by parison to , , and BSA standards on the same gel. BINDING TO BEADS AND THROMBIN CLEAVAGE Alternate Mini Prep Thaw out 1 ml aliquot of fusion protein lysate. Centrifuge to remove precipitate. Incubate 1 ml lysate with ml 50% GST beads. Incubate at 4C with mixing for 1 hour. Centrifuge 5K 239。 in ml eppendorf tubes. Wash the beads 4X with PBST ( % bME optional) and 2X with thrombin cleavage buffer. Stop here if protein bound to beads is needed for binding study. Resuspend the beads in 150 ul thrombin cleavage buffer and add ug thrombin . Incubate at room temperature with mixing for 1 hour. Recover the supernatant containing the fusion protein by centrifugation. Stop the reaction with ul PMSF. Incubate at room temperature 1539。. Add another ul PMSF and incubate another 1539。. MATERIALS PBST: PBS (PhosphateBuffered Saline) + % Tween20 Resuspension Buffer: PBST + 2mM EDTA + % bME Thrombin Cleavage Buffer: Any buffer between pH with Ca++ is adequate. Try 50mM TRIS pH + 150mM NaCl + CaCl2 + % bME 50% Glutathione Agarose Beads (GST Beads) beads per 50ml: Rehydrate beads in large volume of water for at least an hour. Wash with several volumes PBST through Whatman filter on a Buchner funnel to remove maltose stabilizer. Collect gel and add equal volume of PBST. Store at 4C. Do not freeze beads are fragile and ice cr