dna限制酶切反應和限制酶譜繪制(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 外切酶 5’突起 相容 5’突起 第二選擇 第一選擇 不能 不能 不能 5’突起 非相容 5’突起 不能 結合使用接頭 不能 不能 第一選擇 3’突起 相容 3’突起 唯一選擇 不能 不能 不能 不能 3’突起 非相容 3’突起 不能 不能 第一選擇 不能 第二選擇 或平端 3’突起 5’端突起 不能 不能 第一選擇 不能 第二選擇 (補齊后 ) 平端 平端 不能 可能 可能 第一選擇 可能 平端 3’或 5’突起 不能 不能 第一選擇 不能 第二選擇 二 . DNA的連接反應 1. 連接反應理論 當兩種 DNA分子相連時 ,它們可能產生不同的結果 ,這些結果與以下因素有關 : 1) 連接反應系統中的總 DNA濃度 i 2) 一個 DNA分子靠近同一分子另一端的有效濃度 j, 該值與DNA的長度成反比 ,即 DNA分子越大 ,該分子的兩末端越不易相互作用 (即自身環化 ) 3) 兩種不同 DNA分子的克分子濃度之比值 . 2. 連接反應條件 1) 評估連接反應結果的方法 i. 瓊脂糖凝膠電泳 2) 反應條件 i. 溫度 ii. ATP濃度 iii. 時間 iv. 連接酶濃度 第六節 PCR 技 術 一． DNA 體外擴增技術 1. PCR反應體系 1) 基本原理 (PCR—Polymerase Chain Reaction 聚合酶鏈式反應 ) 一個 DNA經 n次擴增后 , 一個 DNA分子可變為 2n個分子DNA擴增需要對待擴增的 DNA序列有所了解，至少要對其兩側的核苷酸序列為已知，以便合成寡核苷酸引物 2) 基本操作 待擴增的 DNA片段 +dNTP+TrisHCl緩沖液 +兩引物 90℃ 變性 30″ 50℃ 退火 30″ 加入 Taq DNA聚合酶 75℃ 1′ 進入第二次循環 2530次循環 90 ℃變性解鏈與引物退火，50 ℃引物及延伸，75 ℃n 次擴增第一次循環第二次循環339。539。339。539。339。539。539。339。539。 339。339。 539。5 39。3 39。339。539。339。339。539。 339。339。 539。5 39。539。339。 539。539。 339。90 ℃變性解鏈與引物退火，50 ℃539。 339。339。 539。5 39。3 39。339。539。539。 339。339。 539。5 39。3 39。339。539。引物及延伸，75 ℃339。339。539。 339。339。 539。5 39。539。339。339。539。 339。339。 539。5 39。539。PCR原理示意圖 2. PCR產物的鑒定 1) PCR產物的大小和限制酶譜分析 b p bp50 0 10 0 600500100RE2) 寡聚核苷酸限制性內切酶片段分析（ OR分析 ，Oligomer Restriction analysis） OR分析對于 PCR產物的限制酶位點上發生了點突變的檢測極其有用 GAC TCCT G GCTG AGGA C CAT339。339。 GAC TCCT G GCTG AGGA C CTA 539。339。339。539。539。539。b e t a A b e t a S GAC TCCT G GATCTG AGGA C C339。339。539。539。*GAC TCCT G GAACTG AGGA C C339。339。539。539。*CTG AGGA C CT339。339。539。539。* GAC TCCTG GA GAC TCCT G GAACTG AGGA C C339。339。539。539。* GGA C CACT CCTG GAA339。339。539。539。* GCTG AGGA C CT339。339。539。539。* GAC TCCTG GAHin fIDde I變性/與標 記寡核苷酸探針復性8 3 PCR產物的 OR鑒定 3) 分子雜交 適合于檢測 PCR產物的非限制酶位點上堿基突變。它是利用兩條引物鏈間的特異性 DNA片段作探針 (常為人工合成的一段低聚核苷酸，約 20 .).當這種探針的核苷酸序列與待測的 DNA核苷酸序列完全互補時才能雜交。如果利用多種等位基因特異性寡核苷酸探針（ allelespecific Oligonucleotide, ASO）與 PCR產物進行雜交，可檢測出 PCR產物的堿基突變。 可直接利用斑點雜交方法用于基因型分析 11 0 bp β 珠蛋白PC 0 3 19 A 19 S 19 C PC 0 419 A 19 S 19 C AAASSSSCCCACXXAAASSSSCCCACXXP C 0 3 : A C A C A A C T G T G T T C A C T A G CP C 0 4 : C A A C T T C A T C C A C G T T C A C C19 C A:C T CC T AG GA GA AG TC TG C19 S T:C T CC TG G GA GA AG TC TG C19A :C T CC TG AG GA GA AG TC TG C 4) 核苷酸序列分析 DNA擴增產物 變性 與末端標記的擴增引物或定序引物退火