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hplc常見問題和對策(編輯修改稿)

2026-02-10 21:37 本頁面

　

【文章內容簡介】溫箱，最有效的辦法就是將色譜柱隔絕在一個溫度波動最小的地方。例如，可把色譜柱置于泡沫塑料套中或色譜包裝盒中，當實驗室溫度基本不變時效果很好，但這種方法必須要允許保留有一些波動。隔絕色譜柱也可以避免結果受環境溫度影響。溫度平衡我們知道，為了保證分離的重現性，色譜柱在梯度洗脫狀態下的必須有平衡過程。當一次梯度洗脫分離完成后，一定要用1015倍柱體積的流動相來沖洗柱子以恢復柱子的平衡。例如，如果使用B溶劑5100%的梯度，柱子為150mm180。（），當流動相從100%的B溶劑換回到5%的B溶劑時，在進行下一次梯度變換之前如果系統沒有平衡,那么保留時間的重現性就會很差。正如柱子不能完全平衡將導致保留時間的重現性差一樣，柱溫不平衡也會導致不理想的后果，這個問題在峰寬上的影響尤其明顯。當溫度變化時除了選擇性和保留時間的變化之外，峰寬也會發生變化。升高溫度通常會使理論塔板數（N）升高，峰寬變窄，由于峰面積不變，峰越窄就會越高，因此升高溫度可以達到更小的檢測限。（這篇文章里的色譜圖不是按同一個y軸比例來畫的，所以峰高的變化沒有表示出來）不用平衡的流動相充分的沖洗柱子會導致化學不平衡狀態，但是當柱子在程序升溫的環境中我們怎樣確定不平衡問題呢？答案取決于柱子中的流動相，如果柱子是在室溫條件下，溶劑瓶、泵和自動進樣器也在室溫下，那么整個系統中的溫度就應該是穩定的。但是，如果柱子是熱的，系統的其他部分和溶劑是室溫，柱頭將比柱尾涼。柱子里的溫度變化將會影響峰形。圖3所示色譜圖中柱溫為38℃，進柱的溶劑為室溫（約22℃），最后一個峰有很明顯的變形。把溶劑瓶、泵、自動進樣器加熱至與柱溫相同是不現實的，所以溶劑預熱器是最好的選擇。我們用1米長，把這個不銹鋼管盤成直徑大約10cm的平面緊貼在柱溫箱里的預熱器上，再讓流路垂直以便預熱器能夠位于自動進樣器和柱子之間，這樣，涼的溶劑從自動進樣器里出來到柱子之前經過這個預熱盤升高了溫度。圖3中的上面一個色譜圖就是增加了預熱器使峰形得到改善。有一些商品柱溫箱就包括這個預熱器。當流動相和柱子之間的溫差增大時，由溫度不平衡而導致的峰變形就會加劇。比較圖35你會發現這個問題很富戲劇性。在77℃時后一個峰變形很大以至于會認為它是兩個成份或者認為柱子有了死體積。在上述情況下當使用了預熱盤以后峰型都變得很漂亮。雖然由于比例不同我們無法看出，其實圖35中所有對應成份的峰面積都是不變的。為什么會看到這些峰變形了呢？這很容易從峰展寬的角度來解釋。前段的溫度比尾部的溫度高，所以前段走的快。當前面比后面走的快的時候就會產生展寬的峰。這種現象和梯度洗脫中有種情況是相對的，就是在一開始使用弱極性溶劑小流速后用強極性大流速。雖然使用預熱器來改善峰形是一個很著名的結論（見參考文獻3）但峰變形的原因仍然很復雜。在理想梯度洗脫中，每個峰都應該在相同的環境中出來而且以相同的速度通過柱子，最后得到相同的峰寬。但是很奇怪后出的峰變形問題比先出的峰要嚴重，正如圖4所示。或許讀者對這個現象會有簡單的解釋。結論我們發現柱溫在液相色譜梯度洗脫過程中扮演了一個重要的角色，首先，提高柱溫可以縮短保留時間，其次，我們看到柱溫還可以影響選擇性，最后，溫度的不平衡會導致峰扭曲變形。這些提醒我們，如果想得到穩定可靠的分離結果，色譜柱的溫度變化是不可忽視的。原因 ① 柱溫波動。（即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差檢測器、電導檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。） ②流動相不均勻。（流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導致的漂移。） ③流通池被污染或有氣體 ④檢測器出口阻塞。（高壓造成流通池窗口破裂，產生噪音基線） ⑤流動相配比不當或流速變化 ⑥柱平衡慢，特別是流動相發生變化時 ⑦流動相污染、變質或由低品質溶劑配成 ⑧樣品中有強保留的物質（高K’值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現出一個逐步升高的基線。 ⑨使用循環溶劑，不提倡。未調整檢測器。 ⑩檢測器沒有設定在最大吸收波長處。解決方法 ①控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器 ②使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動相在使用前進行脫氣，使用中使用在線脫氣或氦氣脫氣。 ③用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用鹽酸） ④取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。 ⑤更改配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速。 ⑥用中等強度的溶劑進行沖洗，更改流動相時，在分析前用1020倍體積的新流動相對柱子進行沖洗。使用離子對試劑、緩沖鹽更應注意平衡柱。 ⑦檢查流動相的組成。使用高品質的化學試劑及HPLC級的溶劑 ⑧改變分析條件。使用保護柱，如有必要，在進樣之間或在分析過程中，定期用強溶劑沖洗柱子。 ⑨重新設定基線。使用新的流動相。 ⑩將波長調整至最大吸收波長處。重選檢測波長。原因 ①在流動相、檢測器或泵中有空氣（尖銳峰） ②漏液。 ③流動相混合不完全。 ④溫度影響（柱溫過高，檢測器未加熱） ⑤在同一條線上有其他電子設備（偶然噪聲） ⑥泵振動。解決方法 ①流動相脫氣。沖洗系統以除去檢測器或泵中的空氣。 ②檢查管路接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封。 ③用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑 ④減少差異或加上熱交換器 ⑤斷開LC、檢測器和記錄儀，檢查干擾是否來自于外部，加以更正。采用精密級穩壓電源。 ⑥在系統中加入脈沖阻尼器原因 ①漏液。 ②流動相污染、變質或由低質溶劑配成 ③流動相各溶劑不相溶 ④檢測器/記錄儀電子元件的問題 ⑤系統內有氣泡 ⑥檢測器內有氣泡 ⑦流通池污染（即使是極少的污染物也會產生噪音。） ⑧檢測器燈能量不足 ⑨色譜柱填料流失或阻塞 ⑩流動相混合不均勻或混合器工作不正常解決方法 ①檢

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