中藥藥理實驗設計(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 材應經過生藥學鑒定（品種、產地）；中藥制劑的處方、劑型、制備工藝及藥品質量應基本穩定；與臨床用藥制劑相同；根據受試藥物特點和試驗方法，藥效試驗可選用不含賦形劑的中藥制劑或提取物。一般要求兩種給藥途徑，并設兩個以上劑量組，靜脈注射給藥及離體試驗宜用水溶性高，不含干擾雜質（如無機離子），PH值接近中性的藥液。粗制劑水溶性差者，可僅用口服給藥。實驗動物選用具有動物飼養合格證的動物。對其品系、性別、年齡、體重、雌雄、健康狀態、飼養條件及動物來源等應有記錄。如：大鼠Wistar品系，雌雄不拘，2~3月齡，150g~180g。小鼠，昆明種，抗炎實驗用雄性。還應注意：1）根據所研究試品的藥理作用，選用與人的疾病特點和機能反應近似的實驗動物。如降壓藥研究，宜選用貓、狗、大鼠，不宜使用家兔，因家兔血壓不穩定，對某些藥物不敏感；過敏性哮喘藥研究，宜選用豚鼠；子宮平滑肌研究，宜選用家兔等；催吐實驗宜選用犬、貓、鴿子，不宜選用家兔或鼠類，因為后者無嘔吐反應。2）選用遺傳背景明確、模型和指標顯著且穩定，解剖生理特點符合試驗目的實驗動物。還應考慮動物是否易得、是否經濟、是否容易飼養管理。如抗AS藥研究，選用鵪鶉、鴿子、家兔，經造模后脂質斑塊易于形成，以鵪鶉優于家兔，其易于飼養，經濟（2元/只），用藥量?。ㄔ炷Ｓ媚懝檀枷牧可伲＝o藥劑量與途徑各試驗至少設兩個劑量組，一般應設三個劑量組，因量效關系起碼要三個劑量組才能顯示出來，其中一個劑量應相當于臨床劑量（一般按公斤體重計算）的2~5倍。小鼠可10~15倍。給藥途徑一般采用二種，其中一種應與臨床相同。實驗結果的處理和分析計數資料（質反應指標，是以“有”或“無”的方式出現，如死亡、睡眠、惇厥等）：常采用x2檢驗進行顯著性測定。計量資料（量反應指標，可以數量表示藥理反應，如血壓、心率、尿量、體溫等）：常用t檢驗方法，如實驗組數多也可采用F檢驗。實驗結果分析，最好以圖表形式表達，圖或表的內容通常包括組別，每組動物數，給藥劑量及所測指標的平均值與標準差（），顯著性測定結果（P值）。（二）一般藥理研究指主要藥效以外的廣泛藥理作用研究。一、二類新藥申報有此要求。主要觀察三個方面：神經系統：觀察給藥后的行為變化及活動情況心血管系統：觀察給藥后的對心電圖及血壓等的影響。呼吸系統：觀察給藥后的對呼吸頻率、節律及深度的影響。（三）藥代動力學研究研究新藥在體內吸收、分布及排泄。中藥材中提取的單一化學成分可測定有關參數。三、中藥新藥毒理學研究的基本內容中藥毒理學研究是預測中藥安全性的重要手段，通過毒性研究可以了解中藥毒性反應的性質、毒性程度、毒害發展過程及毒性作用是否可逆，從而在臨床試驗時注意和采取預防措施，避免產生毒副作用，確保安全用藥。這是新藥審批不可缺少的環節。毒理學研究基本項目通常分為：急性毒性試驗，長期毒性試驗和特殊毒性試驗。以前兩種為常用。（一）急性毒性試驗目的1）估測試品毒性強度：常用動物的致死量表示。根據量效曲線的斜率最大，劑量稍有變化，死亡率變化較大，此點反應靈敏、準確、嚴重性好，因此常以動物半數致死量LD50作為衡量毒性程度的主要指標。藥物的LD50愈小，說明毒性越大。2）觀察試品的毒性癥狀：記錄并了解試品對器官組織損傷部位、損傷程度，反應出現時間，持續時間和恢復時間以及死亡時間。3）計算治療指數：治療指數（Therapeutic index，簡稱TI），等于LD50/ED50。TI可提供新藥粗略的安全范圍。應注意L幫ED50的測定需在同種動物身上，觀察同一試品，采用同一給藥途徑，在相同試驗條件下進行。4）為藥效學及長期毒性試驗選擇劑量提供參考：藥效學劑量可選擇在 1/8~ 1/10LD50之間，在沒有任何參考資料的情況下，長毒劑量在1/3~1/15 LD50之間。半數致死量（LD50）的測定1）實驗動物：多用小鼠6~8周齡，體重18~22g，雌雄各半，正規動物室飼養的健康合格小鼠。2）給藥方法：采用兩種以上途徑，其中包括推薦臨床用藥的給藥途徑。常采用灌胃和注射給藥。如中藥制劑水溶性好的。應測定靜注的LD50，水溶性差，無法通過注射途徑（皮下、腹腔或靜脈）給藥時，可處考慮只用胃腸道給藥。給藥容積：；。3）觀察時間：各中藥毒性反應出現快、慢不同，如果代謝產物中毒，毒性反應可能出現晚些，所以急毒觀察時間不少于7d，如遇遲發性或進行性反應時，還要適當延長至14 d。4）觀察指標：給藥后觀察反應情況，記錄死亡時間、死亡前癥狀，各組動物的死亡數。死亡動物應及時進行尸檢，發現病復器官應做病理組織學檢查。5）環境條件的控制：室溫過涼、過熱都會影響藥物吸收，從而影響藥物的毒性反應。宜控制在20℃上下。動物的食量不僅影響體重，也影響毒性反應，要求給藥前禁食24h，以保證饑飽一致。6）測定方法：如Bliss法、簡化機率單位法、孫氏綜合法（改良冠氏法）等。申報新藥推薦Bliss法。不同方法各有特點，實驗設計不完全相同，但方法上大同小異：首先通過預試找出全死、全不死的劑量，正式試驗時在全死和全不死劑量中間插入2~5個劑量組，每組動物（小鼠）至少10只，♂♀各半，各劑量按等比級數遞增（或遞減），各劑量組和死亡率之間應呈較好的線性關系。LD50及其可信限的計算可參見實驗教材。實驗報告需注明日期，動物品系、規格、數量、受試物來源及含量、各組動物死亡率，動物中毒表現及致死癥狀等。實驗報告需注明日期，動物品種、規格、數量、受試物來源及含量，各且動物死亡率，動物中毒表現及致死癥狀等。最大給藥量（MTD）測定多數中藥毒性較低，口服給藥吸收有限，即使一次給予最大濃度、最大容積（）也難以觀察到死亡反應，即測不出LD50，可以測定其MTD，以反映受試品的毒性情況。方法：采用擬推薦的臨床給藥途徑，最大濃度，最大容積，一般擬一日內2~3次給予動物。小鼠不少于20只，♂♀各半，連續觀察7d。以不引起死亡的最大累計劑量作為最大耐受量（含生藥量g/kg表示），推算相當于臨床用量的倍數。測定MTD量，同樣也應嚴密觀察動物毒性反應，要求與LD50測定時的毒性反應觀察相同。（二）長期毒性試驗如果試品通過藥效學和LD50測定后，表明其有實用價值（有效，短期使用安全），可作長期毒性試驗。長期毒性試驗目的1）觀察動物因連續用藥所產生的毒性反應，中毒開始時間及中毒時首先出現的癥狀。2）確定試品產生主要毒副作用的靶器官，明確毒副作用敏感的指標，供臨床應用時監測。3）觀察停藥后組織功能損害的發展和恢復情況（可逆性觀察）。4）確定、無毒性反應的安全劑量，即無不良反應的最大劑量，為擬定人用安全劑量提供參考。長期毒性試驗的要求1）動物：至少兩種動物（包括嚙齒類和非嚙齒類）。嚙齒類常用大鼠，6周齡，體重100g左右，動物體重差別應控制在平均體重20%范圍內，每組不少于20只，♂♀各半，如試驗周期多于90day，每組增加至♂♀各20只（40只），試驗前至少觀察一周，記錄食量和體重等。非嚙齒類常用狗，4~6個月齡，每組至少4只，♂♀各半。2）劑量：一般設三個劑量組。高劑量組應產生明顯的毒性反應或個別動物死亡，即接近最小致死量；低劑量組應略高于動物的有效量或臨床試用量而不出現任何觀察指標的異常；中劑量組介于兩者之間，應產生輕微毒性反應。各劑量差以等片級數3~5倍，對照組用常水或溶媒。如試品毒性很低，測不出LD50，只設高低兩劑量組，高劑量組一般為擬用于臨床劑量的50倍以上，并應高于藥效學試驗之高劑量和臨床治療量。3）給藥途徑和方法：選擇與推薦臨床試驗的給藥途徑相同?？诜幉捎霉辔阜?。給藥期長于90day者，可把藥品摻入水瓶中的飼料中，但摻入藥量不得超過動物每日進食量的10%，以免影響動物的正常營養，而干擾毒性反應的判斷，同時應保證攝入藥量準確。4）試驗周期：一般為臨床用藥用期的2~3倍。但三、四類中藥制劑，處方中無毒性藥材，無配伍禁忌，又未經化學處理，難以測出LD50，給藥劑量大于200g/kg，臨床用藥期1~3d者，可免做長期毒性試驗。如大鼠長毒無明顯毒性，可免做狗的長毒。5）觀察指標①一般體征、體重、外觀、行為、進食量、糞便等。②血液學檢查：RBC、Hb、WBC及其分類，BPC、凝血 ③血液生化檢查：天門冬氨酸氨基轉移酶AST、丙氨酸氨基轉移酶ALT、堿性磷酸酶ALP、尿素氮BuN、總蛋白TP、白蛋白ALB、血糖GLu、總膽紅素TBIL、肌酐Gma、總膽因醇TCHO。④系統尸檢和病理組織學檢查：由眼觀察異常的器官應重點進行病理組織學檢查。臟器系數（心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、甲狀腺、睪丸、子宮、卵巢、前列腺、腦）。高劑量組發現有異常病變時進行病理組織學檢查（上述臟器及胃、胸腺和可能的靶器官）。⑤狗要做心電圖。第四節 中藥藥理實驗設計一、中藥藥理實驗設計的重要性 實驗設計是很重要的，中藥藥理研究首要的問題，就是對實驗研究的科學、合理、周密設計，因為實驗設計是實驗過程的依據，是實驗數據處理的前提，也是提高實驗研究質量的一個重要保證。嚴密而合理的實驗設計，不但可對實驗結果和誤差有比較準確的估計，最大限度地獲得豐富而可靠的資料，而且還可減少人力，節省物力和時間，提高工作效率，避免因實驗設計不當，造成人力、物力的浪費，甚至全功盡棄的不良結果。因此，實驗研究設計，從中藥藥理實驗研究過程來看，具有非常重要的意義。 二、實驗設計的原則為保證實驗結果的科學性、正確性、減少誤差和偏因。在實驗設計時要注意重復，隨機和對照“三個基本原則”。1）重復：一般說來，實驗重復次數越多，結論越正確、越可靠。但重復次數越多，所消耗人力物力越大。如何用最少的動物、實驗次數得到可以信賴的結果。這是藥理實驗設計必須要考慮的問題，這應按統計學的要求進行。每組該用多少動物才能取得可信的實驗結果，這要根據觀察指標的性質（包括藥物作用的顯著性和結果的離散度等）和動物種類而定。如計量研究（以反應量作為實驗指標）所用動物：小鼠或大鼠每組應不少于10只，豚鼠或家兔每組不少于6只，貓或犬每組不少于4~5只。計數研究（以反應有、無作為指標）所用小鼠或大鼠每組應不少于20~30只。還應考慮實驗操作的難易：復雜的實驗，即使計量實驗用大鼠，5~6只也可以。重復次數要根據實驗要求和性質，主要藥效，指標穩定者，重復2~3次即可。2）隨機：中藥藥理實驗對象為生物樣本，個體差異較大，動物分組必須按隨機原則處理。使每一個體在實驗中都有同等的機會，以減少主觀因素的影響或避免偏性誤差。常用的隨機方法有：①按隨機數字表分組法；②分層分組法：小鼠常采用此法。在稱重同時，將體重不同的小鼠分放于不同鼠盒中，相同體重小鼠放在一起；分組時再將相同體重的小鼠分放于不同的鼠盒中，使每只小鼠均有同等機會分配到各組中去。按此分組的結果，各實驗組小鼠平均體重基本相同。3）對照：比較研究是科學實驗不可缺少的條件，沒有比較就沒有區別，也就談不上科學性。所以藥效學實驗設計必須設立適當的對照組。常用對照組有三種。①正常對照組：即空白對照組，不加任何處理的正常條件下進行觀察的對照。但試驗操作與給藥組相同，如灌胃給藥生在空白對照只給NS（或溶劑），以抵消一些非實驗因素（給藥，捉拿等）的干擾。如實驗需手術者還需設立假手術組。②模型對照組：不用被試品，其他處理與給藥組相同，即經受同樣的造模處理。③陽性對照組：所用藥物是已知藥效確切、藥典收載、部頒標準或正式批準生產的（市場化）同類中藥的西藥。所謂同類，即選用的藥物力求與被研究的新藥主治相同、功效相似，且劑型及給藥途徑均相同者。所用劑量參照被研究新藥臨床等倍量，如被研制新藥中劑量組相當于臨床量15倍時，陽性藥也可采用15倍臨床量給予。陽性對照目的有兩個：其一是檢查方法的可靠性；其二是對此同類新藥之優劣及特點。如：研究某一中藥降血糖作用，觀察對四氧嘧啶致糖尿病小鼠的降糖作用，可設立空白對照組：灌胃NS；模型對照組：靜注四氧嘧啶；陽性對照組：灌胃消渴丸，同時靜注四氧嘧啶；給藥組：灌胃被試中藥，同時靜注四氧嘧啶。各給藥組所測得血糖值比較：模型組與空白組比較，以分析模型是否成功；陽性對照組與模型組比較，以分析本方法是否可靠；給藥組與模型組比較，以分析是否有藥理作用；與陽性對照組比較，以分析兩者作用強度如何。在同次實驗中給藥組與對照組做到“五同”：同時間、同地點、同批動物、同等數量與同等條件三、實驗設計的內容明確研究目的和意義：實驗設計，首先應考慮研究目的和意義，根據研究的中心問題，進行實驗內容設計，做到心中有數，有的放失。確定實驗組和對照組：實驗組和對照組之間除了處理不同，其他條件均應等同。保持實驗可比性的原則。在新藥審批辦法中規定，新藥的主要藥效作用各項實驗均應有空白對照和已知藥物對照。藥理試驗結果需經統計學處理。確定實驗方法、項目和指標：要有明確的規定和說明，要注意選擇能反映被研究問題的本質的關鍵指標。藥理作用及其機理能用客觀方法定性地加以測量，取得準確可靠的數據。確定實驗對象的種類及數量：中藥藥理實驗研究對象包括正常動物、麻醉動物及病理模型；既有整體體內試驗，也有離體器官、組織或細胞體外試驗等。盡量研究各種接近中醫臨床證候的動物病理模型，按中醫藥治則，觀察中藥藥理與療效，但也不排除對正常動物或離體器官等的作用分析。由于動物實驗和臨床觀察畢竟有一定差別，因此考慮用不同動物多種方法測試，往往是必要的。要根據實驗目的、方法的指標的要求決定實驗動物、樣本及數量、計量資料，一般小動物（大、小鼠）每組8—12只，較大動物（兔、狗）每組5—8只是基本的，總量應符合統計要求。資料整理和統計：將紀錄的資料作為必要的分析、整理，經過恰當的統計分析，作出結論。 思考題：中藥藥理實驗設計的三個原則是什么？舉例：1．目的：探討降脂膠囊調血脂作用的效應。：采用高脂飼料喂養法復制大鼠（雄性大鼠）血脂異常模型(高脂飼料配方為：膽固醇2%,豬油10%，%，%,%)：將50只大鼠隨機分為5組，每組10只，分別為空白對照組、模型對照組、降脂膠囊低劑量組（每千克體重14克）、高劑量組（每千