第四章基因操作ppt課件(編輯修改稿)

　

【文章內(nèi)容簡介】 列 。 O Base H H O = P – P – P – O O O O O O O 2’、 3’ddNTP的結構，注意其 3’位置是一個 H而不是 OH，因此后續(xù)的脫氧核苷酸不能接到 3’位上 從 而造成鏈的終止。 Sanger DNA 序列分析示意圖 DNA sequencing gel showing the separation of fragments in the four sequencing reactions (one per lane). In DNA sequencing using dideoxynucleotides labeled with fluorescent dyes, all four ddNTPs are added to the same tube, and during primer extension, all binations of chains are produced. 1620 Automated DNA sequencing using fluorescent dyes, one for each base. 思考題： 假定某一克隆基因的部分序列為5 ， —TCACGTAAGT—3 ， ， 試根據(jù)Sanger序列分析方法原理 畫出測定上述序列的放射自顯影示意圖 ， 并對示意圖作必要的標注和解釋 。 第六節(jié) 基因工程 由基因工程方法產(chǎn)生的生物稱為轉(zhuǎn)基因生物 ， 它一般是指由導入外源 DNA的細胞發(fā)育而成的生物 。 基因工程 □ 定義：根據(jù)分子生物學和遺傳學的原理，將一種生物的遺傳物質(zhì) DNA轉(zhuǎn)移到另一生物體中，使后者獲得新的遺傳性狀或表達出所需要的產(chǎn)物。 一、利用微生物基因工程生產(chǎn)重組基因工程藥物 利用基因工程技術不但能得到大量的具有特殊功能的基因。而且可以讓這些特殊功能的基因生產(chǎn)出具有特殊功能的蛋白質(zhì)藥物，這是目前 基因工程 領域中最活躍最有成果和極富商業(yè)價值的領域之一，究其原因： （ 1）蛋白質(zhì)和多肽是基因表達的直接產(chǎn)物，可用重組 DNA技術進行研究和生產(chǎn)。 （ 2）具有生物活性的蛋白和多肽是珍稀而具有很高醫(yī)療價值的藥物，用常規(guī)分離的方法很難制取。 目前有幾十種基因工程藥物 ， 常用的有：干擾素 、 白細胞介素 、 乙肝疫苗 、 人胰島素和人生長激素等 。 人類最早的商業(yè)化基因工程藥物是 人胰島素和人生長激素， 于 80年代初投放市場 ， 用大腸桿菌來生產(chǎn) ， 是 基因工程 發(fā)展的里程碑 。 □ 胰島素是治療糖尿病的重要藥物 ， 之前從豬或牛的胰腺中提取分離 ， 含量少而且會有毒素 。 □ 人生長激素是治療侏儒癥 ， 青少年增高和促進創(chuàng)傷組織修復的藥物 ， 生長激素具有種屬特異性 ， 從動物腦組織來源的生長激素不能用于人類 ， 之前只能從剛死亡的人大腦垂體中分離純化 ， 來源極有限；而且發(fā)現(xiàn)長期應用會對人類有毒副作用 。 The method used to synthesize rebinant human insulin. 1915 溴化氰 例子 大鼠肝臟 F抗原 蛋白基因在大腸桿菌中表達 F蛋白定位在肝細胞漿中 ， 正常人肝組織中的 F蛋白含量是血清中 1370倍 ， 只有肝細胞被破壞時 ， F抗原才釋放到血漿中 ， 使血清中 F抗原含量升高 ， F抗原用作肝病診斷 ， 首先需獲得純的 F抗原 。目前國內(nèi)外大多采用生化提取的方法從人肝臟組織中分離 F抗原 ， 由于難以得到 F抗原純品 ， 給大量制備診斷試劑帶來困難 。 利用原核 （ 大腸桿菌 ） 表達系統(tǒng) ， 成功表達了大鼠肝臟 F抗原 ， 表達產(chǎn)物經(jīng) SDSPAGE， Westernblot分析 ， 分子量為 43kD， 同時具有 F抗原的免疫學活性 ， 可作為一種基因工程產(chǎn)品用于今后的免疫檢測工作 。 方法： 基因克隆。 提取大鼠肝臟總 RNA，對其進行反轉(zhuǎn)錄和 PCR（ RTPCR）擴增出目的基因（ Fantigen’s cDNA），然后將其與 pET15b載體進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)plyss，在含氨卞青霉素和氯霉素的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。將酶切結果正確的表達質(zhì)粒命名為pET15bF。 表達載體 pET15bF 構建示意圖 F抗原表達 經(jīng) IPTG誘導后，含表達載體 pET15bF的表達菌株表達出一外源蛋白，該蛋白大小在 43kD左右，與文獻報道大鼠 F蛋白大小一致。且在該表達系統(tǒng)中得到高表達， 外源蛋白表達量約占全菌總蛋白的 40%。 F抗原純化與鑒定 離心后所得包涵體蛋白經(jīng)過初步純化和溶解后 ， 經(jīng)過親和層析柱 （ Ni2+charged IDA Hisbind column） 純化 ， 得到一分子量約為43kD的單一蛋白帶 （ 8） 。 表達產(chǎn)物的 Westernblot鑒定結果顯示：該表達蛋白可與豚鼠抗人 F 蛋白的抗血清發(fā)生特異性結合反應 ， 在硝酸纖維素膜上呈現(xiàn)一條分子量為 43kD的顯色帶 （ ） SDSPAGE and Westernblot of the expressed F Antigen (A) molecular weight standard。 induced by IPTG。 body of the lysate。 of the lysate。 noninduced by IPTG。 induced by IPTG。 induced by IPTG。 target protein (B) Westernblot of the purified target protein. Guinea pig polyclonal antiserum against human F antigen was used as primary antibody. (A) 1 2 3 4 5 6 7 8 (B) 二、用真核細胞表達和生產(chǎn)基因工程藥物 雖然用大腸桿菌細胞表達基因工程藥具有許多優(yōu)點 ， 如成本低等 ， 但由于原核系統(tǒng)表達的真核基因蛋白有時缺乏生物活性 ， 其原因由于原核生物缺乏合適的轉(zhuǎn)譯后修飾機制 。 因此用真核細胞表達和生產(chǎn)基因工程藥物已受到重視 。 □ 真核細胞反應器： 外源基因在合適的載體帶動下轉(zhuǎn)染進入體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞 ， 昆蟲細胞或酵母細胞 ， 通過大規(guī)模培養(yǎng)細胞表達外源基因 。 幾種重要的基因工程藥物已可用真核細胞反應器完成 治療癌癥抗病毒 預防病毒性肝炎 治療血友病 治療貧血癥 治療心臟病 促生長，增強免疫功能 酵母菌 酵母菌 哺乳動物細胞 哺乳動物細胞 哺乳動物細胞 昆蟲細胞 α干擾素 乙肝疫苗 集落刺激因子 紅細胞生成素 組織溶纖酶原激活劑 人生長激素 應 用 細 胞 名 稱 昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng) (Insect cell and Baculovirus Expression System) 是一種高效的真核細胞表達系統(tǒng) 桿狀病毒因其病毒粒子呈棒狀或桿狀而得名。 苜蓿尺蠖核型多角體病毒 (Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus， AcMNPV)作為桿狀病毒 昆蟲細胞真核基因表達系統(tǒng)的載體被廣泛應用。 1. 幼蟲吞食了感染有多角體的食物 ,多角體在消化道的堿性環(huán)境下溶解，釋放出病毒顆粒， 2. 每個病毒顆粒的脂蛋白外被又與腸壁細胞的質(zhì)膜相融合，最終將核殼體釋放至胞質(zhì)中，核殼體再將自己的 DNA轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)。 3. 在感染后 12h采用出芽方式離開宿主細胞，在跨過宿主細胞的質(zhì)膜時，以宿主的質(zhì)膜形成自己的外被，形成表型為 出芽型病毒粒子（ budded virus, BV） ， 生活史 Polyhedrin Protein Virion Envolope Nucleocapsid crosssection Nucleocapsid Longitudinalsection Polyhedron envelope DNA蛋白復合體由 39KD衣殼蛋白外被所包圍，形成一個核衣殼，若干個核衣殼外面再包被一層脂蛋白外被就成為病毒顆粒。幾個病毒顆粒聚集成一簇，嵌在晶狀基質(zhì)中成為一個多角體包含體。 多角體包含體的組成 ?桿狀病毒基因表達的級聯(lián)式時序調(diào)控 桿狀病毒的基因表達分為 4個時期：極早期（ immediateearly, α） 、 晚早期 (delayedearly,β)、晚期 (late, γ)和極晚期 (very late, δ)。 通常 ， 每一后續(xù)時期基因的表達水平都高于前一時期基因表達的水平 ， 其中極晚期基因表達水平顯著提高 ， 這也是構建桿狀病毒表達載體的基礎 。 如 Fig所示 。 Fig Schematic representation of the four phases of baculovirus gene expression in vitro 多角體蛋白 P10蛋白 由于 多角體蛋白基因及 P10蛋白基因具有非常高效的啟動子 ， 同時由于 這兩個基因的產(chǎn)物不參與感染病毒顆粒的形成 ， 可以從病毒基因組中去除而不會對病毒的復制及感染造成影響 。 由于這兩個特點 ， 使人們得以設計利用桿狀病毒啟動子在昆蟲細胞中表達外源基因 . 桿狀病毒表達載體構建 由于 AcMNPV基因組的巨大 ， 不可能用單一的限制性酶來對它進行操作 ， 所以目前使用的桿狀病毒表達載體系統(tǒng)大多采用構建轉(zhuǎn)移載體 （ transfer vector）的方法 。 將帶有外源基因的轉(zhuǎn)移載體 DNA和野生型病毒 DNA共轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的昆蟲細胞，使得轉(zhuǎn)移載體與野生型病毒發(fā)生同源重組，外源基因取代多角體基因， 如 Fig所示。通過重組病毒空斑純化得到能表達外源基因的重組病毒。 Transfer vecter Pp Cloned gene Pt 5, 3, Polyhedrin gene AcMNPV DNA Rebinant AcMNPV Fig. 共轉(zhuǎn)染發(fā)生同源重組獲得重組病毒 野生型病毒感染的昆蟲細胞由于存在多角體基因 ， 空斑測定時產(chǎn)生有多角體的空斑（ occ+） 。 重組后由于多角體蛋白基因已被外源基因所取代 ， 只能產(chǎn)生無多角體的空斑（ occ） 。 在光學顯微鏡下根據(jù)折光率的不同可區(qū)分這兩種不同表型的空斑 。 由此經(jīng)過幾輪的空斑純化即可獲得多角體缺陷的重組病毒 。 用重組病毒感染宿主細胞 ， 感染后期得到外源基因的高效表達 。 與野生型病毒共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的昆蟲細胞 用磷酸鈣沉淀法將重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pVL1393hGH與野生型病毒 AcMNPV DNA共轉(zhuǎn)染貼壁培養(yǎng)狀態(tài)良好的 Sf9細胞，由于pVL1393多角體啟動子兩側存在與多角體基因同源序列，可與野生型病毒基因發(fā)生同源重組，從而使人生長激素基因替代野生型病毒中的多角體蛋白基因，得到重組病毒 rAcVhGH 。 重組病毒的 Southern 雜交鑒定 ， hGH cDNA整合 進桿狀病毒基因組的正確位置中 表達產(chǎn)物的 SDSPAGE與 Westernblot分析 三、植物基因工程 □ 定義： 將外源目的基因?qū)塍w外培養(yǎng)的植物組織或細胞，通過組織或細胞培養(yǎng)使之發(fā)育成完整的再生植株 ——轉(zhuǎn)基因植株。 1. 冠癭瘤 ——天然的植物基因工程 自然界某些植物受到農(nóng)桿菌的侵染會形成腫瘤 ——冠癭瘤。其形成的機理是由于 農(nóng)桿菌 中含有的一種誘發(fā)腫瘤的質(zhì)粒所引起的，稱為 Ti質(zhì)粒（ tumorinducing plasmid，簡稱 Ti質(zhì)粒）。 Ti質(zhì)粒上的一段 DNA能轉(zhuǎn)移到侵染的植物部位細胞中，并插入到植物染色體中，由于該片段（稱 TDNA）上具有誘發(fā)腫瘤的基因，所以能誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤。 TDNA Tumor production Nopaline synthesis TDN