發酵技術實驗指導書(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 忌液體流動。 25℃培養 2－ 3 天即有菌落出現。 用接種挑取分生孢子接于察氏培養基斜面， 25℃培養 2－ 3 天。 性能測定 將各分離株接種于酸性蔗糖培養基中（ 500mL 三角瓶中裝有培養基 25mL）， 30℃振蕩培養 24－ 48 小時 。 檸檬酸鑒定 取 5mL 發酵液于潔凈試管中，加 Deniges 氏液 1mL，加熱至沸，然后一滴一滴地加入高錳酸鉀溶液，若有白色沉淀，即證明有檸檬酸存在。 生酸量的測定 以常規酸堿中和的方法測定，檸檬酸的毫克當量為 ，以此計算出檸檬酸的百分含量。 五、實驗結果 描述產檸檬酸黑曲霉的菌學特征。 記錄性能測定的結果。 六、思考題 黑曲霉的工業用途主要有哪些？ 實驗六 啤酒酵母發酵力的測定 一、實驗目的和要求 了解酵母發酵力的測定的原理及應用； 學習酵母發酵力的測定操作技術。 二、實 驗原理 酵母菌的發酵力反映酵母對各種糖類的發酵情況，一般包括二氧化碳失重的測定、發酵度的測定和酒精度測定。正常的啤酒酵母能發酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖和麥芽三糖等。但酵母的酶系不同，發酵糖的能力也不同，發酵過程中除產生乙醇外，還伴有二氧化碳形成，形成的二氧化碳從發酵液中揮發出，使整個體系的重量減輕，根據減輕的程度，可測定發酵速率的快慢；發酵度測定是基于酵母降糖的能力，即發酵前后發酵液中糖分減少的幅度；對酒類工業，酵母菌的產酒能力要求較高，一般的酒度測定常采用蒸餾法。 三、實驗材料 菌種 釀 酒酵母。 培養基 麥芽汁。（見實驗四或附錄） 試劑和器具 發酵瓶、發酵栓、比重瓶、恒溫水浴、燒瓶、冷凝器。 四、實驗方法 取無菌的 500mL 三角瓶，內裝 12oBrix 的麥芽汁或 1822oBrix 果汁 250mL，加棉塞滅菌，冷卻后接種培養 24 小時的酵母種子液 ，然后將棉塞換成發酵栓，于 2025℃培養 110 天。 二氧化碳失重的測定 接種完畢后，稱重發酵瓶，在發酵過程中每 8 小時稱量一次，稱前應先搖晃瓶子，以趕除二氧化碳，隨著發酵時間的延續，瓶重逐漸減輕，直到減 輕量不高于 ，即表示發酵完畢。然后以產生二氧化碳的量為縱坐標，發酵時間為橫坐標，繪制發酵速率曲線。 發酵度的測定 （ 1）原麥汁濃度的測定（用附溫比重瓶法）將附溫比重瓶用洗液浸泡，取出后徹底洗滌為中性，再用乙醇、乙醚順序洗滌數次，吹干后準確稱量（用分析天平），此數據為 W1，即比重瓶的重量。然后用煮沸 30 分鐘，冷卻至 15℃的蒸餾水注滿比重瓶，裝上溫度計（瓶中應無氣泡），立即浸入 20177。 ℃恒溫水浴中，到比重瓶上的溫度計達到 20℃，并保持 2030 分鐘不變后取出，用濾紙吸去測管的水，立即蓋上罩放置 ，直到比重瓶升到室溫后擦干，稱其重量，此數值為 W3，即比重瓶和水的重量。傾出比重瓶中的水，先用約 10mL 過濾麥芽汁（已滅菌）洗滌 23 次后，注滿麥汁，按上法測定其重量，此數值為 W2，即為樣品和比重瓶的重量。那么樣品（即過濾麥汁）的比重 D2020 可以由下式表示： D2020 =（ W2－W1） /（ W3－ W1），即 20℃樣品與同體積 20℃水的重量之比值。然后從《啤酒工業手冊》中可查出 20℃樣品比重對應得樣品濃度，即原麥汁濃度（用 P 表示原麥汁濃度） 。 附溫度計的比重瓶：如上圖所示。左為 精密比重瓶，右為普通比重瓶 l比重瓶； 2支管標線； 3支管上小帽； 4附溫度計的瓶蓋 （ 2）外觀濃度的測定（用 m表示） 用比重瓶法測得發酵液或成品酒 20℃時的比重，從《啤酒工業手冊》查出浸出物含量，即為外觀濃度。 （ 3）真正濃度的測定（用 n表示） 取一蒸餾燒瓶，向其中加入 100g 除去氣體并經過過濾的發酵液， 80℃左右蒸出其中的酒精，待蒸出三分之二時， 自然冷卻，稱量。加蒸餾水補足 100g，再置于 15℃水中搖勻，然后用附溫比重瓶法測得此液體的比重，查《啤酒工業手冊》得此液體中浸出物的含量，即為外觀濃度。 發酵度的計算可由下式求得： 外觀發酵度 = 原麥汁濃度 觀濃度原麥汁濃度－發酵液外 179。 100%= PmP－ 179。 100% 真正發酵度 = 原麥汁濃度 餾后的真濃度原麥汁濃度－發酵液蒸 179。 100%= PnP－ 179。 100% 酒精度的測定 用 100mL 的容量瓶（烘至恒重）稱取 100g 除去氣體的發酵液 或成品啤酒。轉入 500mL 燒瓶中，用 50mL 蒸餾水分數次洗滌容量瓶，并轉入燒瓶中，連接好冷凝器，加熱緩慢蒸餾。再將一個已知重量的 100mL 容量瓶浸入冰水中，接收蒸出的蒸餾液。當流出液體積為 90mL 左右時，停止蒸餾，將蒸餾液重量調至 100g，混合均勻，用附溫比重瓶法測定蒸餾液 20℃時的比重，然后從《啤酒工業手冊》中查出酒精的重量百分比。 根據測得的酒精重量百分比還可計算發酵率。因為每 100g 的葡萄糖可產純酒精的數量為 ，則發酵率可由下式求得： 發酵率 =理論生成的酒精數實際生成的酒精數179。 100% 五、實驗結果 以產生二氧化碳的量為縱坐標，發酵時間為橫坐標，繪制發酵速率曲線。 記錄發酵度測定的結果，計算發酵度。 記錄酒精度測定的結果，計算發酵率。 六、思考題 發酵力測定的意義主要有哪些？一般包括哪些測定內容？ 實驗七 酵母菌熱死溫度的測定 一、實驗目的和要求 了解酵母菌熱死溫度測定的原理及意義； 學習酵母菌熱死溫度測定的操作技術。 二、實驗原理 熱死溫度是指液態培養的微生物，在某溫度下 10 分鐘即被殺死，此溫度稱為微生物的熱死溫度。啤酒酵母一般在 45℃時就停止生 命活動，熱死溫度一般在 5054℃，測定酵母菌的熱死溫度是掌握酵母性質必須具備的知識之一。 酵母的熱死溫度往往受培養基的含水量，微生物細胞的含水量，培養基的pH 值，培養基中氮的含量、細胞的菌齡和是否形成孢子等影響，為了防止這種缺點，習慣上先將試驗酵母移到液體培養基中，在 25℃培養 24 小時，或者從擴大培養的酵母中采取。 酵母的熱死溫度除與培養基種類有關外，與加熱時間長短也有關。在啤酒廠所選擇的溫度為 4060℃。每個間隔溫度為 2℃，保溫時間多以 510 分鐘為度，在啤酒廠習慣用 10 分鐘作為測定的保溫時間。 三 、實驗材料 菌種 釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）和熱帶假絲酵母（ Candida tropicalis）。 培養基 1214oBrix 麥芽汁。（見實驗四或附錄） 儀器和器具 恒溫水浴箱、恒溫箱、無菌移液管、計時表、溫度計、酒精燈、酒精棉球。 四、實驗方法 取盛有 5mL 的滅菌麥芽汁（ 1214oBrix）試管一組，每管用無菌吸管接入用麥芽汁培養 24 小時后的酵母懸液 ，取已接種的試管 3 支浸入 40℃中保溫，其中 1 支管中插入溫度計，另兩支 不插，當插溫度計的試管溫度達到 40℃時，開始記錄時間，并保持 10 分鐘，立即拿出，放到冷水中冷卻。然后用同樣的方法測定其它溫度，如 42℃、 44℃、 46℃、??以至 60℃再將各組試管置 25℃保溫箱中，培養后觀察。 五、實驗結果 在一周培養時間內，不能產生發酵現象的最低溫度，就是該酵母的熱死溫度。但通常情況下，則以此測得的最低溫度加 12℃為該酵母的熱死溫度。如酵母在52℃保溫 10 分鐘培養后沒有發酵現象，則該酵母的熱死溫度為 5354℃。 酵母熱死溫度的改變，說明菌種發生變異，或受野生酵母的污染（野生酵母比培養 酵母有更高的耐熱性），檢查所使用的酵母是否被污染，這也是啤酒巴氏滅菌確定溫度的依據。國內各啤酒廠所使用的啤酒酵母熱死溫度多為 52℃。 六、思考題 什么是熱死溫度？酵母的熱死溫度的影響因素有哪些？ 若酵母的熱死溫度發生改變，則引起的原因是什么？ 實驗八 酵母菌凝集力的測定 一、實驗目的和要求 了解酵母菌凝集力的測定原理與應用； 學習酵母菌凝集力測定的操作技術。 二、實驗原理 啤酒酵母菌及葡萄酒酵母菌的凝集性在生產上具有特殊的重要性，也是區別菌株的一項重要內容。由于凝集性的不同，酵母菌的 沉降速度就不一樣，發酵度也有差異，如果酵母菌菌種發生變異或污染了野生酵母時，則會改變其凝集性，給生產帶來困難。 三、實驗材料 菌種 釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）和糖化酵母（ Saccharomyces diastaticus）。 培養基 麥芽汁培養基。（見實驗四或附錄） 試劑和器具 pH 值為 的醋酸緩沖液，刻度離心管、接種環、離心管、離心機、無菌水、酒精燈、計時器等。 四、實驗方法 將試驗的酵母菌接種于麥芽汁發酵瓶中， 25℃培養 7 天，取培養 液裝于離心管中，離心（ 3500 轉 /分， 15 分鐘）收集酵母細胞，然后用無菌水洗滌 23 次。取酵母泥，準確稱量 1g，放于刻度離心管中，然后加入 10mL 醋酸緩沖液（ pH 值 ），搖勻，使其成懸浮狀態。在 20℃水浴中靜置 20 分鐘，再將此懸液連續搖動 5 分鐘，使酵母重新懸浮，再靜置，在 20 分鐘內每分鐘記錄一次沉淀酵母菌的容積。 五、實驗結果 一般，將 10 分鐘時酵母菌沉淀的容積稱為本斯值。通過此值可估計酵母菌的凝集性，沉淀容積為 以上者為弱凝集性，而為 以下者為弱凝集性。上述的試驗前后要求懸浮液的 pH 值不變。 六、思考題 酵母菌的凝集性在生產上的特殊重要性是什么？ 若酵母的凝集性發生改變，則引起的原因是什么？ 第二節 微生物育種 開發微生物資源的關鍵是獲得所需要的菌種，優良的微生物菌種是工業微生物技術的關鍵和基礎。理想的工業發酵菌種多數是通過育種手段得到的。選育優良的生產菌種并保持其穩定的生產特性，是發酵工業中極其重要的工作。自然選擇、人工誘變、原生質體融合等，尤其是誘變育種，在微生物菌種選育中曾經發揮極其重要的作用，現在仍然是重要的選育手段。 實驗一 紫外線誘變育種 —— 繪制細胞存活 率和突變率曲線 一、實驗目的和要求 進一步理解誘變劑對微生物的殺菌和誘變雙重生物學效應； 學習紫外線誘變的方法及測定誘變劑最適劑量的方法。 二、實驗原理 紫外線的生物學效應主要是它能引起 DNA 結構變化造成的。紫外線具有殺菌和誘變雙重生物學效應。隨著照射時間的增長，殺菌率和突變率隨之提高。但照射繼續增加到一定程度時，其殺菌率也隨之增大，而突變率卻降低。 紫外線強度單位（劑量）為爾格 /毫米 2。由于測定困難，在實際誘變育種中，常采用紫外線照射時間或細胞的死亡率表示相對劑量，其中以細胞死亡率表示方法具有實際 意義。 本實驗以枯草芽孢桿菌腺嘌呤缺陷型菌株（ ade）為出發菌株，以營養缺陷型的回復突變作為誘變效應的指標，測定紫外線誘變劑的最適劑量。以照射時間為橫坐標，以細胞存活率或死亡率和突變率為縱坐標作圖，突變率最高值相對應的細胞死亡率即為最適劑量。 三、實驗材料與儀器 菌種 枯草芽孢桿菌腺嘌呤缺陷型菌株（ ade）。 培養基 肉湯培養基，細菌基本培養基。 試劑和器具 生理鹽水，誘變箱，磁力攪拌器，涂布器，離心管，培養皿等。 四、實驗方法 菌體 培養 取斜面菌種一環，接種于盛有 20ml肉湯培養基的 250ml 三角瓶中， 37℃ 振蕩培養 6－ 18h，取 1ml 培養液轉接于另一盛有 20ml 肉湯培養基的三角瓶中， 37℃ 振蕩培養 6－ 8h，使細胞培養處于對數增殖期狀態。 細胞懸浮液的制備 取 10ml 培養液，離心（ ， 10min）收集菌體。沉淀用 10ml 生理鹽水洗滌離心 2 次。然后將菌體充分懸浮于 12ml 生理鹽水中。 活菌計數法測定細胞懸浮液濃度 取 1ml細胞懸浮液，逐步稀釋為 10－ 10－ 10－ 3??。取最后 3 個稀釋度菌液各 1ml，置于平皿中，然后傾入 15ml融化并冷卻至 45－ 50℃ 的肉湯固體培養基，充分地混勻，凝固后置于 37℃ 培養1－ 2 天，計數每平皿菌落數（每個稀釋度作三個平行）。按下式計數每毫升細胞懸浮液菌體濃度。 細胞數（個 /毫升）＝菌落數（三平皿平均值）179。稀釋倍數 誘變處理 （ 1）取 10ml 菌液于直徑 90mm 培養皿中（帶有磁棒），將皿放置于誘變箱的磁力攪拌器上。 （ 2）開啟紫外線燈，預熱 20min 后，開啟磁力攪拌器，打開皿蓋，分別照射 1 4 60、 7 90s）。 （ 3）取不同時間誘變處理菌液 1ml，按照 3 的方法作適當稀釋，測定處理液中存活細胞濃度（每時間作 3 個稀釋度，每個稀釋度作 3 皿平行）。結果填入表 1。 （ 4）取（ 3）中同樣的稀釋菌液毫升，置于平皿中，傾入融化并冷卻至 45－ 50℃的細菌基本培養基 15ml，充分混勻，凝固后置 37℃ 培