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分子生物學檢驗技術實驗指導(編輯修改稿)

2026-05-01 23:13 本頁面

　

【文章內容簡介】原理】聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）用于體外擴增位于兩段已知序列之間的DNA區段（靶序列）。其原理是通過耐熱DNA聚合酶催化的DNA合成反應達到對靶序列的擴增。反應中使用兩條化學合成的寡核苷酸作為引物，分別與模板DNA兩條單鏈互補，待擴增序列片段位于兩條引物之問。PCR擴增包括3個步驟，即變性、退火和延伸。反應需要模板、引物、DNA聚合酶和脫氧核糖三磷酸(dNTP)等的參與。反應混合液被加熱以使模板DNA雙鏈變性成為二條單鏈，隨后將反應混合液冷卻至引物的熔點溫度(Tm)以下，使引物能與靶序列形成雜交雙鏈（退火）。當溫度升至72℃左右時，反應體系中的DNA聚合酶按照模板鏈的序列以堿基互補方式依次把dNTP加至引物的3’端，使互補鏈從5 ‘向3’方向不斷延伸，直至形成新的DNA雙鏈。通過變性、退火和延伸的一個循環可以使靶序列的分子拷貝數增加一倍。由于每次擴增的產物又作為下一次擴增的模板，因此反應產物的量以指數形式增長，一個分子的模板經過n個循環可得2n個分子拷貝產物。本實驗擴增的是小鼠肝組織平滑肌收縮蛋白（SM22α）基因，擴增產物片段大小為541bp。擴增所用的上游引物序列為：5’AGTTATATTAATTTTGCATAGTGCCTGGTTG3’，下游引物序列為：5’GCGCTAGCTACAAGGCTTGGTCGTTTG3’。【實驗器材和試劑】設備PCR儀、 PCR反應管、移液器、吸嘴、旋渦混合器。試劑（20 μl體系）PCR試劑盒（北京康為世紀生物科技公司）【操作步驟】分別在PCR反應管中加入2 PCR mix 10 μl、上游和下游引物各2 μl、DNA 2 μl和H2O 4 μl。把PCR反應管放人PCR儀，按儀器操作要求啟動擴增程序。本實驗的擴增程序為：94℃預變性5分鐘后進入循環擴增，即94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1 min。重復35個循環后，于72℃再延伸10 min，最后4℃保溫。反應結束后，將PCR反應管于12000 rpm離心15s，取擴增產物進行電泳分析。【注意事項】由于PCR技術的靈敏度高，極微量的污染也會造成擴增的假陽性結果。因此，必須采取相應措施避免發生污染。PCR實驗應設立陰性對照反應，即在反應體系中不加模板DNA。多份樣品同時擴增時，可配制總的反應混合液，并分裝于PCR管中，然后再在各管中分別加入模板。臨床診斷用PCR反應必須在專門的PCR實驗室中進行，實驗室應包括試劑配制室、模板制備室、PCR擴增室和產物檢測室等功能區。PCR實驗中的各個步驟應在相應的功能區中進行。PCR試劑與模板DNA及樣品應分別保

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