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微生物學目的與要求內容(編輯修改稿)

2026-05-04 03:30 本頁面

　

【文章內容簡介】最好從小雞的頸部空隙中插入。 5．注射完畢后，用膠布封口（膠布先經碘酒消毒和通過火焰燒去余碘處理）。用過的注射器煮沸消毒處理。雞胚放入35～37℃培養48～72小時。 6．自注射后次日起逐日檢查雞胚的生活情況，2日以內死亡者多為非特異性損傷而致死；2日后死亡者視為特異性死亡，流感或副流感病毒10－3稀釋注射時，一般不引起死亡。收獲病毒之前將雞胚移入普通冰箱18～24小時，將雞胚凍死，以減少收獲時的出血。 7．冰箱取出雞胚，碘酒消毒雞蛋氣室端，撕去膠布并將蛋殼窗口擴大，用小鑷子撕破卵膜及絨毛尿囊膜，然后用毛細管吸出尿囊液棄去，尿囊液吸完后，左手持鑷子鑷住羊膜腔，右手以毛細吸管插入羊膜腔吸取羊水，一般羊水可吸出一毫升左右。 8．滴定羊水的病毒血凝效價。羊膜腔接種方法適用于一些呼吸道病毒，如流感病毒、副流感病毒及流行性腮腺炎病毒等的分離。卵黃囊氣室卵白羊水尿囊液圖 103羊膜腔接種法四、病毒細胞培養法及病變觀察（錄像）細胞培養法是目前培養病毒應用最廣的一種培養方法，其優點是（1）經濟適用，結果正確且敏感；（2）較實驗動物易于控制。細胞培養法多應用于病毒的分離培養，進行血清中和試驗及制造疫苗和抗原等方面。很多組織細胞，包括雞胚、鼠胚、各種動物的腎組織細胞，人胚羊膜組織細胞或流產胎兒組織細胞（應在死后6小時內采取，因時間過長，組織細胞生長成功率下降）等均可作細胞培養的來源。細胞的選擇主要依據組織細胞對病毒的敏感性。能引起病變的組織細胞，往往取自病毒的自然宿主，特別是引起疾病的宿主的某些臟器組織細胞。人類病毒，用人或猴的組織細胞較敏感，但這不是絕對的，如地鼠腎細胞較人腎細胞對流行性乙型腦炎病毒敏感。（一）原代細胞培養法【材料】9～10日齡雞胚、Hanks氏溶液、％胰酶溶液、無菌小剪、鑷子、無菌培養皿、毛細吸管、吸管、沉淀管、無菌細胞培養管（抗生素空瓶）、100毫升無菌玻璃瓶或三角燒瓶、備有四層紗布的玻璃漏斗。【方法】1．用碘酒消毒雞胚蛋氣室外殼，并將它直立于蛋架上，以鑷子將雞胚取出放入無菌培養皿內，去頭爪及內臟。2．用小剪在培養皿內將胚胎剪成小塊（4～5毫米3），加Hanks氏溶液（約10毫升）沖洗，靜置1～2分鐘后，用毛細吸管吸取液體。依同法再洗滌2次，將血球充分洗去。3．用鑷子將組織塊放入無菌玻璃瓶或三角燒瓶內，加入10～％胰酶溶液，37℃水浴20分鐘，中間搖動幾次。由于胰酶的作用可使大量細胞游離，液體變混。經四層紗布過濾后的細胞懸液，低速離心沉淀（1000轉/分以內）5分鐘，吸取上清液，沉淀物加入適量營養液，用白細胞計數的方法進行計數，使成每毫升含50～80萬細胞懸液以作單層細胞培養。4．每一細胞培養管，注入細胞懸液1毫升，蓋好瓶塞，并將瓶略加搖動，橫臥于有槽木架上，使細胞均勻平鋪于管壁。置37℃溫箱孵育，一般4小時，細胞附著于管壁，48小時可長成單層，此時即可調換營養液，接種病毒。（二）傳代細胞培養法從人及動物組織，特別是腫瘤組織，經過多次傳代可建立傳代細胞系。這種細胞能無限地傳代，但并不是所有的組織細胞都能建立傳代細胞。有一些傳代細胞對病毒敏感范圍較廣，曾被利用作病毒的分離和鑒定。如HeLa細胞，Hep－2細胞及KB細胞。HeLa細胞對脊髓灰質炎三型病毒，腺病毒及大多數實驗室適應的ECHO病毒都敏感。Hep－2細胞也曾用來分離脊髓灰質炎病毒、柯薩奇A組病毒、腺病毒、RS病毒。HeLa細胞來自子宮頸癌，Hep－2細胞來自喉癌，而KB細胞來自上腭癌。由于傳代細胞有致腫瘤作用，目前僅用做病毒的分離鑒定及一些病毒學的研究而不能用于疫苗的生產。【材料】單層細胞培養瓶，營養液，％胰蛋白酶溶液，無菌吸管，無菌細胞瓶。【方法】1．將成片細胞的生長液倒掉，用Hanks液洗一次。2．％胰蛋白酶，37℃孵育1分鐘。3．將細胞瓶倒放，細胞在上，胰酶在下，繼續孵育37℃5～10分鐘。4．將胰蛋白酶倒掉，再加入原量的生長液，用10毫升吸管吹打分散細胞。5．用生長液按原量3～4倍稀釋，即一瓶細胞能傳3～4瓶。（三）細胞培養接種病毒的方法及病變觀察（示教）【材料】單層細胞培養管、營養液、Hanks溶液、無菌毛細滴管和腺病毒稀釋液。【方法】1．取已長成單層細胞的培養瓶二只，用無菌毛細滴管吸去管中液體，用Hanks溶液洗二次。2．，細胞瓶放平，使其接觸整個細胞層，置37℃作用1小時，使病毒吸附到細胞上。3．取出單層細胞瓶，蓋緊后置37℃孵箱中培養1～2天。4．取出細胞在低倍顯微鏡下觀察，注意種毒與對照二管的細胞形態，排列等。注：為方便保存，此處觀察的細胞已經過固定和染色。五、血凝抑制試驗血凝抑制試驗系利用血凝素特異性抗體與病毒表面相應血凝素相互作用，使病毒血凝現象抑制的試驗。血凝抑制試驗適用于具有血凝素的病毒，試驗必須預先滴定病毒的血凝效價，然后采用一定量的病毒，通常是加入4個血凝單位的病毒，在與血凝滴定試驗相同的反應條件下來進行測定。（一）血凝效價的滴定【材料】收獲的尿囊液（病毒懸液）、32孔有機玻璃板。 ml移液器、移液頭、小試管一支、％雞紅細胞懸液、生理鹽水【方法】按下表進行，其操作程序為： 1．將有機玻璃板孔從1～10號進行編號，從第一孔起直至第10孔。 2．將尿囊液在試管中作1∶5稀釋。

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