微生物檢測實驗指導(xxxx版)(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 大腸桿菌(Escherichia coli)和福氏志賀菌（Shigelle flexneri）2) 培養基 葡萄糖銨培養基(附錄Ⅲ8),普通營養瓊脂斜面。3) 其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，無菌生理鹽水8mL(二支)．四、方法與步驟1） 做標記 取葡萄糖銨培養基、普通營養瓊脂斜面、無菌生理鹽水個2支，分別于其上做好培養基名稱和菌名等標記。2） 制備菌懸液 將苗種相應接人理鹽水管內，研磨并攪動使其均勻。要求每一接種環內含菌數在20—100個為宜（或肉眼觀察不見渾濁）。3） 接種 用無菌接種環分別取大腸桿菌菌液一環，在對應的葡萄糖銨斜面培養基和普通營養瓊脂斜面培養基上劃線接種，并以同樣的方法接種福氏志賀菌。4） 培養 將種接好的試管置36℃土1℃恒溫箱培養24h，觀察結果。五、實驗結果 在葡萄糖銨斜面上有正常大小菌落生長者為葡萄糖銨試驗陽性，記“十”號；不生長或只生長為極微小的菌落，而在對照培養基上生長良好者，為陰性，否則記“一”。將觀察結果以表格方式記錄。實驗六 酪蛋白分解試驗 一、實驗目的 (1)了解酪蛋白分解試驗的用途及原理． (2)學習酪蛋白分解試驗的操作技術． 二、原理 某些菌具有酪蛋白分解酶，而有的菌則不具有。具有酪蛋白分解酶的細菌在 蛋白瓊脂平板上可分解酪蛋白而令菌落周圍形成透明圈。三、實驗材料（1）菌種 蠟樣牙孢桿菌和球形芽孢桿菌。(2) 培養基 酪蛋白瓊脂培養基平板(附錄Ⅲ—19)(3) 其它 酒精棉球，酒精燈，接種環，恒溫箱等。四、方法與步驟以劃線接種法將試驗菌接種于酪蛋白培養基上，然后置37℃恒溫箱培養1—2d后，觀察結果五、實驗結果平板中菌落周圍有透明圈者，為酪蛋白分解試驗陽性。反之為陰性．***注：培養基在倒時要搖勻（因為酪蛋白不溶解） 倒好后，培養基放置時間要較長（凝固時間較長）實驗七 細胞色素氧化酶試驗 一、實驗目的 (1)了解細胞色素氧化酶試驗的用途與原理． (2)學習細胞色素氧化酶試驗的操作技術． 二、原理 在不以氧為直接受氫體的生物氧化體系中，生物氧化需要在多種酶聯合作用下方能進行。組成這類生物氧化體系的酶，主要是細胞色素類酵。這種酶在有分子氧與脫氫酶的存在下，可氧化二甲基對苯撐二胺和α—萘酚成吲哚酚藍，其反應式同氧化酶試驗．三、實驗材料 (1)菌種 大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草桿菌(13acill~subtilis)。 (2)試劑 同氧化酶試驗。四、方法與步驟 取37℃培養20h的斜面培養物一支，將兩種試劑各2—3滴順斜面從上端滴下，并將斜面略加傾斜，使試劑混合液流經斜面上的培養物。如系平板培養物，則可用試劑混合液滴到菌落上。五、實驗結果 在兩分鐘內呈現藍色者為陽性，2min以后出現微弱或可疑反應者均作為陰性結果. 實驗九 淀粉水解試驗 一、實驗目的 (1)了解淀粉水解試驗的原理及用途。 (2)學習淀粉水解試驗的操作技術。二、原理 許多菌產生淀粉酶，能把培養基中的淀粉水解為無色糊精的等小分子，或進—分解為麥芽糖和葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色．三、實驗材料 (1)菌種 大腸桿菌(Escherichiacoil)和枯草芽抱桿酶(Bacillussubtilis)。 (2)培養基 %的可溶性淀粉。 (3)試劑 路哥氏碘液(附錄1—3．2)‘ (4)其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。 四，方法與步驟 將培養基熔化，倒成平板，凝固后，取菌種點種于平板上，每皿可點3—5個菌，37℃恒溫箱培養2—4d后，觀察結果五、實驗結果取培養好的平皿，在平板上滴加路哥氏碘液以鋪滿菌落周圍為度，平板呈藍色，而菌落周圍如有無色透明圈出現，說明淀粉已被水解，稱淀粉水解試驗陽性。透明圈的大小一般說明水解淀粉能力的大小。實驗八 過氧化氫酶試驗—，實驗目的1)了解過氧化氫酶試驗的用途與原理。2)學習過氧化氫酶試驗的操作技術。二、原理 在以需氧脫氫酶催化的氧化體系中，氧原子接受電子后，即與溶液中氫離子結合，生成過氧化氫，此物對微生物有毒性。有的菌具有過氧化氧酶，可將其分解成水和氧，但有的菌不具有此酶．故過氧化氫酶試驗是鑒別菌種的依據之一。 三、實驗材料 (1)菌種 大腸桿菌(Escherichia coli)和某種乳酸桿菌(Lactobacillus sp)。 (2)培養基肉湯培養基(附錄Ⅱ—1．1),麥汁培養基. (3)試劑 3%過氧化氫溶液． (4)其它 酒精棉球，酒精燈，潔凈小試管，接種環等。四、方法與步驟從斜面挑取一環菌種置于潔凈試管內，滴加3%過氧化氫溶液約2mL,觀察結果。五、實驗結果于半分鐘內產生氣泡者，為過氧化氧酶試驗陽性；不發生氣泡者，為陰性。菌落總數測定1 范圍本標準規定了食品中菌落總數的測定方法。本標準適用于各類食品中菌落總數的測定。2 術語與定義下列術語和定義適用于本標準。 菌落總數 食品檢樣經過處理，在一定條件下培養后（培養基成分、培養溫度和時間、PH、需氧性質等），所得1ml（或1g）檢樣中形成菌落的總數。本標準規定的培養條件下所得結果，只包括一群在平板計數瓊脂上生長發育的嗜中溫需氧菌或兼性厭氧菌的菌落總數。3 設備和材料除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下： 恒溫培養箱：36℃177。1℃，30℃177。1℃。 冰箱：2℃~5℃. 恒溫水浴箱：46℃177。1℃. 天平：. 均質器。 振蕩器。 無菌吸管：1ml（）、10 ml（）或微量移液器及吸頭。 無菌錐形瓶：容量250ml、500ml。 無菌培養皿：直徑90mm PH計或PH比色管或精密PH試紙。 放大鏡或菌落計數器或petrifilm自動判讀儀。4 培養基和試劑4. 1 平板計數瓊脂培養基：見第A..1章。4. 2 磷酸鹽緩沖液：見第A..2章。4. 3 無菌生理鹽水：，121℃高壓滅菌15min。 1mol/L氫氧化鈉（NaOH）：稱取40g氫氧化鈉溶于1000ml蒸餾水中。 1mol/L鹽酸（HCL）:移取濃鹽酸90ml用蒸餾水稀釋1000ml。 petrifilm菌落總數測試片和壓板。第一法 平板菌落計數法5 檢驗程序 菌落總數的檢驗程序見圖1檢樣25g（或25 ml）樣品+225ml稀釋液，均質10倍系列稀釋選擇2個~3個適宜樣品勻液，各取1ml分別加入無菌培養皿內每皿中加入15ml~20ml平板計數瓊脂培養基，混勻 培 養36℃177。1℃48h177。2h計數各平板菌落數 計數菌落總數報 告 圖1 菌落總數的檢驗程序6 操作步驟樣品的稀釋固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內，8 000r/min~10 000r/min 均質1min~2min,或放入盛有225ml稀釋液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min~2min,制成1：10的樣品勻液。液體樣品：以無菌吸管吸取25ml樣品置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分混勻,制成1：10的樣品勻液。用1ml無菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1ml，沿管壁緩慢注于盛有9ml稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用一支無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用一次1ml無菌吸管或吸頭。根據對樣品污染狀況的估計，選擇2個~3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取1ml樣品勻液加入兩個無菌平皿內。同時分別取1ml稀釋液加入兩個無菌平皿左空白對照。及時將15ml~20ml冷卻至46℃的平板計數瓊脂培養基（可放置于46℃177。1℃恒溫水浴箱中）傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。培養 瓊脂凝固后，將平板翻轉，36℃177。1℃培養48h177。2h。水產品30℃177。1℃培養72h177。3h. 如果樣品中可能含有在瓊脂培養基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養基（約4ml），凝固后翻轉平板。 菌落計數可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位（colonyforming units,CFU）表示。 選取菌落數在30CPU~300CPU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低于30CFU的平板記錄具體菌落數，大于300的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以，代表一個平板菌落數。 當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。7 結果的表述 菌落總數的計算方法 若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每克（或毫升）中菌落總數結果。 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時，按式（1）計算： 式中： N樣品中菌落數； ∑C平板(含適宜范圍菌落數的平板)菌落數之和； n1 第一個適宜稀釋度平板上的菌落數； n2第二個適宜稀釋度平板上的菌落數； d 稀釋因子（第一稀釋度）。示例： 稀釋度1；100（第一稀釋度）1；100（第二稀釋度）菌落數232，24433，35，則對所有稀釋度最高的平板進行計數，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計數。，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計數（包括液體樣品原液）的平板均無菌落數生成，則以少于1乘以最低稀釋倍數計數。~300之間，其中一部分小于30或大于300時，則以最接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。 菌落總數的報告，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數字報告。 大于或等于100時，第三位數字采用“四舍五入”原則修約后，取用兩位數字，后面用0代替位數；也可用10的指數形式表示，按四舍五入原則修約后，采用兩位有效數字。 若所有平板上蔓延菌落而無法計數，則報告菌落蔓延。 若空白對照有菌落生成，則這次檢測結果無效。 稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/ml為單位報告。第二法菌落總數Petrifilm TM測試片法8 檢驗程序除將平板計數瓊脂培養基改成PetrifilmTM 菌落總數測試片外，其他與第5 章相同。9 操作步驟 樣品的稀釋 制備1:10 的樣品勻液后，用1 mol/L 氫氧化鈉（NaOH ）或1 mol/L 鹽酸( HCL ）調節pH 。 接種根據對樣本污染狀況的估計，選擇2 個~3 個適宜稀釋度的樣品勻液進行檢驗。將測試片置于平坦實驗臺表面，揭開上層膜，用吸管或微量移液器吸取1 mL 樣品勻液，垂直滴加在測試片的中央，將上層膜蓋下，允許上層膜直接落下，但不要滾動上層膜，將壓板（凹面底朝下）放置在上層膜中央，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養膜上，切勿扭轉壓板。拿起壓板，靜置至少1 min 以使培養基凝固。每個稀釋度接種兩張測試片。 培養將測試片的透明面朝上，水平置于培養箱內。可堆疊至20 片， 。 計數 培養結束后立即計數，可肉眼觀察計數，或用菌落計數器、放大鏡、PetrifilmTM 自動判讀儀計數。選取菌落數在30 300 之間的測試片計數。 計數所有紅色菌落。細菌濃度很高時，整個測試片會變成紅色或粉紅色，將結果記錄為“多不可計”。 有時，當細菌濃度很高時，測試片中央沒有可見菌落，但圓形培養膜的邊緣有許多小的菌落，其結果也記錄為“多不可計”；進一步稀釋樣品可獲得準確的讀數。 某些微生物會液化凝膠，造成局部擴散或菌落模糊的現象。如果液化現象干擾計數，可以計數未液化的面積來估算菌落數。10 結果的表述同第7章附錄A(規范性附錄)培養基和試劑A 1 平板計數瓊脂(plate count agar，PcA)培養基A 1 1成分 胰蛋白胨 g 酵母浸膏 g 葡萄糖 g 瓊脂 g 蒸餾水 1 000 mL pH A 1 2制法 將上述成分加于蒸餾水巾A 2磷酸鹽緩沖液A 2 1成分 磷酸二氫鉀(KH2P04) 蒸餾水 PH A 2 2制法GB／T 4789 2—2∞8煮沸溶解，調節PH。分裝試管或錐形瓶，121℃高壓滅菌15 min500mL 貯存液： g的磷酸_二氫鉀溶于500mL蒸餾水中， mL的1 mol／1．氫氧化鈉溶，蒸餾水稀釋至1 000 mL后貯存于冰箱。 稀釋液： mL，用蒸餾水稀釋至l 000 mL，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15 min。大腸桿菌計數1 范圍 本標準規定了食品中大腸菌群計數的方法。 本標準適用于各類食品中大腸菌群的計數。2 術語和定義 下列術語和定義適用于本標準。