微生物檢驗技術(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 扎（現試管一般多有用螺旋蓋者）。分裝時最好能使用半自動或電動的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養基時，分裝量應以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當。分裝容器應預先清洗干凈并經干烤消毒，以利于培養基的徹底滅菌。每批培養基應另外分裝20ml培養基于一小玻璃瓶中，隨該批培養基同時滅菌，以為測定該批培養基最終pH之用。８、培養基的滅菌　　一般培養基可采用121176。C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養基制備方法中，如無特殊規定，即可用此法滅菌。　　某些畏熱成分，如糖類，應另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無菌操作技術、定量加于培養基。明膠培養基亦應用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應以無菌操作技術抽取和加入于經冷卻約50176。C左右的培養基中。　　瓊脂斜面培養基應在滅菌后立即取出，冷至55℃60℃時，擺置成適當斜面，待其自然凝固。９、培養基的質量測試　　每批培養基制備好以后，應仔細檢查一遍，如發現破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養基沾染等、均應挑出棄去。并測定其最終pH。　　將全部培養基放入36177。1176。C恒溫箱培養過夜，如發現有菌生長，即棄去。　　用有關的標準菌株接種1~2管或瓶培養基，培養24~48小時，如無菌生長或生長不好。應追查原因并重復接種一次，如結果仍同前，則該批培養基即應棄去，不能使用。培養基的保存　　培養基應存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內。放置時間不宜超過一周，傾注的平板培養基不宜超過3天。每批培養基均必須附有該批培養基制備記錄副頁或明顯標簽。接種、分離純化和培養技術　　一、接種　　將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養基上或活的生物體內的過程叫做接種。１、接種工具和方法　　在實驗室或工廠實踐中，用得最多的接種工具是接種環、接種針。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時滴管、吸管也可作為接種工具進行液體接種。在固體培養基表面要將菌液均勻涂布時，需要用到涂布棒。（圖３－３）　圖３－３　接種和分離工具1．接種針 　　　　　常用的接種方法有以下幾種：　　１）劃線接種 這是最常用的接種方法。即在固體培養基表面作來回直線形的移動，就可達到接種的作用。常用的接種工具有接種環，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。　　２）三點接種 在研究霉菌形態時常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落后，來觀察、研究它們的形態。除三點外，也有一點或多點進行接種的。　　３）穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常采用此法。做穿刺接種時，用的接種工具是接種針。用的培養基一般是半固體培養基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養基中心向管底作直線穿刺，如某細菌具有鞭毛而能運動，則在穿刺線周圍能夠生長。　　４）澆混接種 該法是將待接的微生物先放入培養皿中，然后再倒入冷卻至45176。C左右的固體培養基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達到稀釋的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養，就可長出單個的微生物菌落。　　５）涂布接種 與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長出單個的微生物的菌落。　　６）液體接種 從固體培養基中將菌洗下，倒入液體培養基中，或者從液體培養物中，用移液管將菌液接至液體培養基中，或從液體培養物中將菌液移至固體培養基中，都可稱為液體接種。　　７）注射接種 該法是用注射的方法將待接的微生物轉接至活的生物體內，如人或其它動物中，常見的疫苗預防接種，就是用注射接種，接入人體，來預防某些疾病。　　８）活體接種 活體接種是專門用于培養病毒或其它病原微生物的一種方法，因為病毒必須接種于活的生物體內才能生長繁殖。所用的活體可以是整個動物；也可以是某個離體活組織，例如猴腎等；也可以是發育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養。２、無菌操作　　培養基經高壓滅菌后，用經過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養基上，這個過程叫做無菌接種操作。在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。　　實驗臺面不論是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒劑擦洗；水平是倒瓊脂培養基時利于培養皿內平板的厚度保持一致。在實驗臺上方，空氣流動應緩慢，雜菌應盡量減少，其周圍雜菌也應越少越好。為此，必須清掃室內，關閉實驗室的門窗，并用消毒劑進行空氣消毒處理，盡可能地減少雜菌的數量。　　空氣中的雜菌在氣流小的情況下，隨著灰塵落下，所以接種時，打開培養皿的時間應盡量短。用于接種的器具必須經干熱或火焰等滅菌。接種環的火焰滅菌方法：通常接種環在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉動一邊慢慢地來回通過火焰三次），冷卻，先接觸一下培養基，待接種環冷卻到室溫后，方可用它來挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養基上。（圖３－４）然后，將接種環從柄部至環端逐漸通過火焰滅菌，復原。不要直接燒環，以免殘留在接種環上的菌體爆濺而污染空間。平板接種時，通常把平板的面傾斜，把培養皿的蓋打開一小部分進行接種。在向培養皿內倒培養基或接種時，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應傾斜一下在火焰上通過。　圖３－４　斜面接種時的無菌操作(1)接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞二、分離純化　　含有一種以上的微生物培養物稱為混和培養物（Mixed culture）。如果在一個菌落中所有細胞均來自于一個親代細胞，那么這個菌落稱為純培養（Pure culture）。在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養物。得到純培養的過程稱為分離純化，方法有許多種。１、傾注平板法　　首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50176。左右的營養瓊脂培養基充分混合，然后把這混合液傾注到無菌的培養皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養。單一細胞經過多次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復上述步驟數次，便可得到純培養物。（圖３－５，a）圖３－５　傾注平板法（a）涂布平板法（b）圖解 ２、涂布平板法　　首先把微生物懸液通過適當的稀釋，取一定量的稀釋液放在無菌的已經凝固的營養瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養基表面上，經恒溫培養便可以得到單個菌落。（圖３－５，b）３、平板劃線法　　最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環取培養物少許在平板上進行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。（圖３－６）當接種環在培養基表面上往后移動時，接種環上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個細胞，經培養，每一個細胞長成一個菌落。（圖３－７）４、富集培養法　　富集培養法的方法和原理非常簡單。我們可以創造一些條件只讓所需的微生物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進行競爭，在生長能力方面遠遠超過其他微生物。所創造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在相同的培養基和培養條件下，經過多次重復移種，最后富集的菌株很容易在固體培養基上長出單菌落。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應敏感宿主細胞群體中，使其大量生長。通過多次重復移種便可以得到純的寄生菌。　　　　圖３－６　平板劃線分離法 ５、厭氧法　　在實驗室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養基的試管作為培養容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數分鐘，以便逐出培養基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進行接種。接種后，加入無菌的石蠟于培養基表面，使培養基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用N2或CO2取代培養基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離的樣品接種于培養基上，然后再把培養皿放在完全密封的厭氧培養裝置中。三、培養　　微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養物濃度、溫度、水分、氧氣、ＰＨ等。微生物的種類不同，培養的方式和條件也不盡相同。１、影響微生物生長的因素　　微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到外界許多因素的影響。影響微生物生長的因素很多，簡要介紹如下。1) 營養物濃度 細菌的生長率與營養物的濃度有關:μ=μmax*C/(K+C) 　　營養物濃度與生長率的關系曲線是典型的雙曲線。　　K值是細菌生長的很基本的特性常數。它的數值很小，表明細菌所需要的營養濃度非常之低，所以在自然界中，它們到處生長。然而營養太低時，細菌生長就會遇到困難，甚至還會死亡。這是因為除了生長需要能量以外，細菌還需要能量來維持它的生存。這種能量稱為維持能。另一方面，隨著營養物濃度的增加，生長率愈接近最大值。２）溫度　　在一定的溫度范圍內，每種微生物都有自已的生長溫度三基點：最低生長溫度、最適生長溫度和最高生長溫度。在生長溫度三基點內，微生物都能生長，但生長速率不一樣。微生物只有處于最適生長溫度時，生長速度才最快，代時最短。超過最低生長溫度，微生物不會生長，溫度太低，甚至會死亡。超過最高生長溫度，微生物也要停止生長，溫度過高。也會死亡。一般情況下，每種微生物的生長溫度三基點是恒定的。但也常受其它環境條件的影響而發生變化。　　根據微生物最適生長溫度的不同，可將它們分為三個類型：　　：其是適生長溫度多數在10℃－20℃之間　　：其最適生長溫度一般在20℃－45℃之間　　：生長溫度在45℃以上。３）水分　　水分是微生物進行生長的必要條件。芽孢、孢子萌發，首先需要水分。微生物是不能脫離水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生長，而不能生活在純水中。各種微生物在不能生長發育的水分活性范圍內，均具有狹小的適當的水分活性區域。４）氧氣　　按照微生物對氧氣的需要情況，可將它們分為以下五個類型。　　　　這類微生物需要氧氣供呼吸之用。沒有氧氣，便不能生長，但是高濃度的氧氣對需氧微生物也是有毒的。很多需氧微生物不能在氧氣濃度大于大氣中氧氣濃度的條件下生長。絕大多數微生物都屬于這個類型。　　　　這類微生物在有氧氣存在或無氧氣存在情況下，都能生長，只不過所進行的代謝途徑不同罷了。在無氧氣存在的條件下，它進行發酵作用，例如酵母菌的無氧乙醇發酵。　　　　這類菌是需要氧氣的。這可能是由一它們含有在強氧化條件下失活的酶，因而只有在低壓下作用。　　　　這類微生物在生長過程中，不需要氧氣，但也不怕氧氣存在，不會被氧氣所殺死。　　　　這類微生物在生長過程中，不需要分子氧。分子氧存在對它們生長產生毒害，不是被抑制，就是被殺死。２、培養方法1）根據培養時是否需要氧氣，可分為好氧培養和厭氧培養兩大類。　　好氧培養：也稱“好氣培養”。就是說這種微生物在培養時，需要有氧氣加入，否則就不能生長良好。在實驗室中，斜面培養是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養多數是通過搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進入瓶中。　　厭氧培養：也稱“厭氣培養”。這類微生物在培養時，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養過程中，最重要的一點就是要除去培養基中的氧氣。一般可采用下列幾種方法：　　：常將還原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，加入到培養基中，便可達到目的。有的將一些動物的死的或活的組織如牛心、羊腦加入到培養基中，也可適合厭氧菌的生長。　　：這也有很多方法，主要有：用焦性沒食子酸吸收氧氣；用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧混合培養吸收氧氣；用植物組織如發芽的種子吸收氧氣；用產生氫氣與氧化合的方法除氧。　　：深層液體培養；用石蠟油封存；半固體穿刺培養。　　 用二氧氣碳驅代氧氣；用氮氣驅代氧氣；用真空驅代氧氣；用氫氣驅代氧氣；用混和氣體驅代氧氣。２）根據培養基的物理狀態，可分為固體培養和液體培養兩大類。　　固質培養：是將菌種接至疏松而富有營養的固體培養基中，在合適的條件下進行微生物培養的方法。　　液體培養：在實驗中，通過液體培養可以使微生物迅速繁殖，獲得大量的培養物，在一定條件下，還是微生物選擇增菌的有效方法。微生物常規鑒定技術一、形態結構和培養特性觀察 １、微生物的形態結構觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細胞結構（包括細胞壁、細胞膜、細胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進行觀察，直觀地了解細菌在形態結構上特性，根據不同微生物在形態結構上的不同達到區別、鑒定微生物的目的。２、細菌細胞在固體培養基表面形成的細胞群體叫菌落（colony）。不同微生物在某種培養基中生長繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的細菌在一定條件下，培養特征卻有一定穩定性。，以此可以對不同微生物加以區別鑒定。因此，微生物培養特性的觀察也是微生物檢驗鑒別中的一項重要內容。　　１）細菌的培養特征包括以下內容：在固體培養基上，觀察菌落大小、形態、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養中的表面生長情況（菌膜、環）混濁度及沉淀等。半固體培養基穿刺接種觀察運動、擴散情況。（圖３－８）　圖３－８　細菌的培養特征 　　２）霉菌酵母菌的培養特征：大多數酵母菌沒有絲狀體，在固體培養基上形成的菌落和細菌的很相似，只是比細菌菌落大且厚。液體培養也和細菌相似，有均勻生長、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長，在條件適宜的培養基里，菌絲無限伸長沿培養基表面蔓延。霉菌的基內菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無色，基內菌絲褐色。霉菌在固體培養表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網狀菌落。二、生理生化試驗　　微生物生化反應是指用化學反應來測定微生物的代謝產物，生化反應常用來鑒別一些在形態和其它方面不易區別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據之一。　　微生