病原生物學(xué)實(shí)習(xí)指導(dǎo)(編輯修改稿)

　

【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 l肉水中加入蛋白胨10g、氯化鈉5g，加熱溶解，放涼。 3．用精密pH試紙測(cè)酸堿度，用10％。過堿時(shí)，可用10％醋酸校正之。 4．分裝于試管中或三角燒瓶中，15磅(121℃)高壓蒸氣滅菌20～30min。 如用市售的牛肉膏代替新鮮肉水時(shí)，～％的水溶液，再如上法制成培養(yǎng)基。(二)普通瓊脂培養(yǎng)基 普通瓊脂培養(yǎng)基是常用的固體培養(yǎng)基，包括普通瓊脂平板和普通瓊脂斜面兩種，前者用于分離純種細(xì)菌，后者用于增殖純種細(xì)菌或保存菌種。 【材料】 ① 肉水 200ml ② 蛋白胨 2g ③ 氯化鈉 1g ④ 瓊脂 5g ⑤ 無菌平皿、滅菌試管、三角燒瓶等。 【方法】 1．按上記數(shù)量把肉水、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂放到三角燒瓶中，加熱溶化。 2．趁熱用pH試紙測(cè)酸堿度，用10％。 3．15磅高壓蒸氣滅菌20～30min。 4．趁熱將溶化的培養(yǎng)基倒入滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)平皿倒入約15ml，凝固后即成普通瓊脂平板培養(yǎng)基；如趁熱將培養(yǎng)基倒入滅菌試管內(nèi)，再將試管斜放試驗(yàn)臺(tái)上，凝固后即成普通瓊脂斜面培養(yǎng)基。 瓊脂系由海藻中提取的一種多糖，俗稱洋粉，具有100℃溶化，40℃凝固的特性。細(xì)菌不能分解瓊脂，故無營(yíng)養(yǎng)作用，僅是固體培養(yǎng)基的賦形劑。 普通瓊脂培養(yǎng)基也可用市售的營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉(含有普通瓊脂培養(yǎng)基的各種成分并已調(diào)好pH)制備，用法見產(chǎn)品說明書。(三)血液瓊脂培養(yǎng)基 有些細(xì)菌其營(yíng)養(yǎng)要求較高，在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不良，可用血液瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。 【材料】 ① 普通瓊脂培養(yǎng)基 200ml ② 血液(脫纖維羊血或兔血) 10～20ml 【方法】 1．加熱溶化普通瓊脂培養(yǎng)基。 2．待冷至50℃左右時(shí)，加入無菌的脫纖維血液，混勻(注意勿使產(chǎn)生泡沫)。 3．分注于滅菌試管或平皿中制成血斜面和血平板培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)2 細(xì)菌分離培養(yǎng)與純培養(yǎng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法是指將臨床材料接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(Media)上進(jìn)行孵育，分離獲得純種細(xì)菌的方法。只有獲得純種細(xì)菌才能鑒定細(xì)菌，研究細(xì)菌的生物學(xué)特性、致病性及對(duì)藥物的敏感性，進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療疾病。本次實(shí)驗(yàn)的目的是學(xué)習(xí)細(xì)菌分離培養(yǎng)與純培養(yǎng)法，掌握幾種常用的細(xì)菌接種技術(shù)。 【材料】 ① 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌24h混合肉湯培養(yǎng)物 ② 普通瓊脂平板培養(yǎng)基 ③ 普通瓊脂斜面培養(yǎng)基 ④ 肉湯培養(yǎng)基 ⑤ 革蘭氏染色液 ⑥ 生理鹽水 ⑦ 載物玻片，接種環(huán)等。 【方法】1．平板培養(yǎng)基接種的分離培養(yǎng)法 平板培養(yǎng)基具有較大的表面積，用于從混雜的檢查材料中分離出純種細(xì)菌，其要點(diǎn)是如何獲得較多的孤立菌落。最常用的平板接種法是劃線法，根據(jù)檢查材料中含菌量的多少，可采用不同的劃線方法：①連續(xù)劃線法：檢查材料中含菌量較少時(shí)，可用本法。先將接種環(huán)用火焰滅菌，待冷卻后挑取檢查材料，涂于平板的上端，隨即向下連續(xù)平行劃線至平板的中部，然后將平板旋轉(zhuǎn)180176。，由平板的另一端連續(xù)平行劃線至平板的中部(圖2—1a)。劃線時(shí)接種環(huán)與平板表面所成的角度要小，以免劃破瓊脂。劃線要密而不重復(fù)，充分利用平板的表面。 ②分段劃線法：檢查材料中含菌量較多時(shí)，可用此法以求獲得孤立菌落。先將檢查材料涂于平板上端后，然后將接種環(huán)用火焰滅菌，冷卻后使接種環(huán)通過已涂于平板上端的接種材料劃線于“1”區(qū)(圖2—1b)。再將接種環(huán)火焰滅菌，待冷卻后再劃線于“2”區(qū)。同法再劃線于“3”區(qū)。可根據(jù)菌量的不同，決定分段的數(shù)目。劃線完畢，先蓋好平板，再將接種環(huán)上殘留的細(xì)菌用火焰滅菌。在平皿底面，用特殊鉛筆寫上班級(jí)、學(xué)號(hào)和材料號(hào)，然后使平皿底面向上放于鐵絲筐中，送37℃溫箱培養(yǎng)，經(jīng)18～24h，可觀察有無孤立菌落生長(zhǎng)，每一孤立菌落即為一純種細(xì)菌。一般病原菌的菌落數(shù)少于雜菌，故在分離培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)力求出現(xiàn)較多的孤立菌落，以提高病原菌檢出率。 【結(jié)果觀察】 ①菌落形態(tài)：首先一般先觀察整個(gè)平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及種類，然后再選有代表性的各種孤立菌落做如下的詳細(xì)觀察。 大小：一般可描述為針尖大、粟粒大等，也可按實(shí)測(cè)mm數(shù)表示之。 大菌落(直徑在5mm以上) 中等大菌落(直徑在3mm左右) 小菌落(直徑在1mm左右) 形狀：點(diǎn)狀、圓形、卵圓形、葉狀等。 邊緣：整齊、鋸齒狀、毛發(fā)狀等。 表面：光滑、皺紋、濕潤(rùn)、干燥等。 隆起度：凸起、扁平、中心凹陷等。 結(jié)構(gòu)：均質(zhì)性、顆粒狀等。 色調(diào)：無色、白色、黃色、褐色等。 透明度：透明、半透明、不透明等。 觀察菌落時(shí)，不要將空氣中落入培養(yǎng)基而生長(zhǎng)的雜菌誤認(rèn)為目的細(xì)菌。雜菌一般生長(zhǎng)于劃線痕跡外，或?yàn)閭€(gè)別的形狀異常的孤立菌落。另外觀察時(shí)，也要注意保護(hù)好平板，勿使再落入雜菌。 ②細(xì)菌形態(tài)：選擇經(jīng)肉眼詳細(xì)觀察過的不同種類的孤立菌落各一個(gè)，用特殊鉛筆在平皿底部作圈記并編號(hào)，然后再涂膜，做革蘭氏染色。 涂膜方法：先取載物玻片，用特種鉛筆在玻片背面畫兩個(gè)圓圈，并寫上與平皿上菌落相同的號(hào)碼。用接種環(huán)按無菌操作取材法沾取生理鹽水，于每一圓圈內(nèi)各放一滴。再用接種針按無菌操作法分別從選好的菌落上挑取細(xì)菌，按編號(hào)在載物片上涂于生理鹽水內(nèi)，做成薄而均勻的涂膜。挑菌時(shí)不要取菌太多，不要觸碰其它菌落，涂膜切勿太厚，否則影響鏡檢效果。染色后鏡檢，注意觀察視野內(nèi)是否為形態(tài)相同的純種細(xì)菌，注意其形態(tài)、排列、染色性等，如有不同，則可能挑菌時(shí)觸碰其它菌落，應(yīng)另選菌落涂片染色。以上所學(xué)習(xí)的是最經(jīng)典的培養(yǎng)方法，目前臨床檢驗(yàn)常使用全自動(dòng)培養(yǎng)儀，大大提高了培養(yǎng)的效率和質(zhì)量。全自動(dòng)快速血培養(yǎng)儀（Bact Alert 120）能從血液和體液中快速檢出需氧菌、厭氧菌、L型細(xì)菌和真菌，一般24h內(nèi)檢出率達(dá)85%，48h內(nèi)檢出率達(dá)95%以上。2．斜面培養(yǎng)基接種的純培養(yǎng)法 斜面培養(yǎng)基不易污染，常用于培養(yǎng)純種細(xì)菌。斜面培養(yǎng)基通常也采用劃線接種法。接種時(shí)，右手持接種環(huán)，先將接種環(huán)滅菌，待冷后挑取平板上孤立菌落的細(xì)菌。將平板放回原處后，用左手取斜面培養(yǎng)基，用右手小指和手掌拔去試管棉塞，將試管口通過火焰略微加熱滅菌，再將接種環(huán)插入試管(勿觸碰管壁)，由斜面底部向上劃一直線，然后再從斜面底部向上連續(xù)平行劃線(圖2—2)。劃線完畢，再將試管口通過一下火焰，棉塞滅菌后，塞好棉塞，最后將接種環(huán)上的殘留細(xì)菌用火焰滅菌。接種好的斜面培養(yǎng)基放37℃溫箱培養(yǎng)18～24h，所接種的細(xì)菌則生長(zhǎng)為均質(zhì)的菌苔。此培養(yǎng)物來自孤立菌落，為純種，可用于該菌的各種生物學(xué)性狀檢查。3．液體培養(yǎng)基接種法可采用“雙管移植法”(圖2—3)，將瓊脂斜面上生長(zhǎng)的細(xì)菌移植于肉湯培養(yǎng)基中，即左手持細(xì)菌培養(yǎng)物和肉湯培養(yǎng)基兩支試管，右手持接種環(huán)，按無菌操作法取少量細(xì)菌，在肉湯表面稍上的管壁上輕輕研磨，使細(xì)菌混入培養(yǎng)基內(nèi)。接種后放37℃溫箱培養(yǎng)18~24h，肉眼觀察，如培養(yǎng)基出現(xiàn)混濁或形成菌膜、沉淀等，則表示有細(xì)菌增殖，觀察其增殖狀態(tài)，有助于鑒別細(xì)菌。4．高層培養(yǎng)基接種法 細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室為保存菌種或測(cè)定細(xì)菌有無動(dòng)力，常制成固體或半固體的高層培養(yǎng)基，某些生化性狀檢查也使用高層培養(yǎng)基(如醋酸鉛培養(yǎng)基)。高層培養(yǎng)應(yīng)采用穿刺接種法，用接種針取菌落或斜面培養(yǎng)基上的純種細(xì)菌，穿刺于培養(yǎng)基的中心，但不可直刺至試管底，一般刺入高層培養(yǎng)基三分之二高度即可(圖2—4)。實(shí)驗(yàn)3 細(xì)菌生化反應(yīng)檢查法 有些細(xì)菌雖屬于不同種或型，但其形態(tài)和菌落特點(diǎn)基本相同，只依靠形態(tài)和菌落的觀察，不能加以區(qū)別。然而，這些不同種型的細(xì)菌，其物質(zhì)代謝能力和產(chǎn)物常有所不同，借此可以鑒別細(xì)菌，即為細(xì)菌的生化反應(yīng)檢查，生化反應(yīng)檢查必須使用純種細(xì)菌。本次實(shí)驗(yàn)的目的是了解細(xì)菌生化反應(yīng)常用培養(yǎng)基的制備方法和學(xué)習(xí)常用于腸道桿菌鑒別的幾種生化反應(yīng)。（一）細(xì)菌生化反應(yīng)常用培養(yǎng)基的制備 1．蛋白胨水 成分：、蒸餾水100ml ，分裝試管，15磅15min高壓滅菌備用。常用于制備糖發(fā)酵培養(yǎng)基或用于檢查細(xì)菌的靛基質(zhì)產(chǎn)生試驗(yàn)等。 2．糖發(fā)酵管 成分：蛋白胨水，葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖或麥芽糖等糖，溴甲酚紫(B．C．P)、溴麝香草酚蘭(B．T．B)或酚紅(P．R)等指示劑。 在蛋白胨水中加入某種糖(～1％)和指示劑，分裝于帶一倒立小管的小試管中(圖2—5)，15磅20min高壓滅菌后備用。常用于糖發(fā)酵試驗(yàn)。 3．葡萄糖蛋白胨水 成分：蛋白胨 葡萄糖 磷酸氫二鉀 蒸餾水 100ml，分裝試管，10磅20min高壓滅菌備用。用于V—P試驗(yàn)和甲基紅試驗(yàn)。4．枸櫞酸鹽培養(yǎng)基成分：枸櫞酸鈉 硫酸鎂 磷酸二氫銨 磷酸氫二鉀 氯化鈉 瓊脂(經(jīng)流水連續(xù)徹底漂洗) 蒸餾水 100ml(％) ，％B．T．B乙醇溶液混勻，分裝試管，8磅15min高壓滅菌，趁熱取出置成斜面。 用于枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)。 5．醋酸鉛培養(yǎng)基 成分：普通瓊脂培養(yǎng)基 100ml 硫代硫酸鈉 醋酸鉛溶液(10％) 1ml 先溶化普通瓊脂培養(yǎng)基，然后加入硫代硫酸鈉，煮沸過濾，10磅20min高壓滅菌，取出后無菌操作加入已滅菌的10％醋酸鉛溶液1ml，混勻后裝于小試管，直立凝固后備用。用于檢測(cè)硫化氫的產(chǎn)生。 6．尿素培養(yǎng)基 成分：蛋白胨 氯化鈉 磷酸二氫鉀 瓊脂 蒸餾水 100ml 酚紅溶液(％) 葡萄糖溶液(10％) 尿素(20％) 1ml 在蒸餾水內(nèi)加熱溶化蛋白胨、氯化鈉、磷酸二氫鉀和瓊脂，％酚紅溶液混勻，8磅15min高壓滅菌，取出待冷至60℃，加入滅菌的10％葡萄糖溶液和20％尿素，分裝于小試管內(nèi)，凝成斜面?zhèn)溆谩Ｓ糜谀蛩胤纸庠囼?yàn)。 (二)細(xì)菌生化反應(yīng)檢查法 1．糖發(fā)酵(Fermentation of sugars) 將細(xì)菌接種于糖發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察結(jié)果。必要時(shí)可培養(yǎng)更長(zhǎng)時(shí)間后再判定結(jié)果。 細(xì)菌如分解糖時(shí)，則產(chǎn)酸，使指示劑變色(一般記錄符號(hào)是“十”)；有些細(xì)菌在分解糖的同時(shí)還產(chǎn)生氣體，則倒立小管中有氣泡出現(xiàn)(記錄符號(hào)為“⊕”)；如細(xì)菌不分解該糖時(shí)，指示劑不變色，不見培養(yǎng)液混濁(記錄符號(hào)為“―”)。 2．IMViC 包括下述四種試驗(yàn)：① 靛基質(zhì)產(chǎn)生(Production of indole)將細(xì)菌接種于蛋白胨水中，37℃培養(yǎng)18～24h。有些細(xì)菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸而產(chǎn)生靛基質(zhì)，靛基質(zhì)無色，不能直接查見，此時(shí)滴加數(shù)滴靛基質(zhì)試劑(Kovacs試劑)于培養(yǎng)基的液面上，其接觸面呈玫瑰紅色者為陽性，仍呈黃色者為陰性，若顏色不明顯，可再加4～5滴乙醚，振蕩試管使乙醚分散于液體中，若培養(yǎng)液中有靛基質(zhì)存在，就可以被提取至乙醚層中，顏色反應(yīng)較為明顯。 (注)Kofacs試劑：取對(duì)二甲基氨基苯甲醛(Paradimethylamino benzaldehyde)4g，加95％酒精380ml，濃鹽酸80ml即成。 ② 甲基紅試驗(yàn)(Methyl red test) 將細(xì)菌接種于葡萄糖蛋白胨水中，37℃培養(yǎng)48h后，再向其中加入甲基紅試劑3滴。大腸桿菌等細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，但丙酮酸不被縮合成乙酰甲基甲醇，培養(yǎng)基中酸多，pH值低，故呈紅色，為陽性。而產(chǎn)氣桿菌將丙酮酸縮合成乙酰甲基甲醇，培養(yǎng)基中酸少，pH值高，故呈黃色，為陰性。 注：甲基紅試劑：，溶于60％的酒精100ml中。該試劑酸性時(shí)呈紅色，堿性時(shí)呈黃色。 ③ VP試驗(yàn)(VogesProskauer test) 將細(xì)菌接種于葡萄糖蛋白胨水中，37℃培養(yǎng)48h后，再向培養(yǎng)基中加入等量的40％氫氧化鉀溶液(％肌酸)。產(chǎn)氣桿菌分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸又被縮合成乙酰甲基甲醇，后者遇堿被空氣中氧氧化，生成二乙酰，二乙酰又和培養(yǎng)基中的胍基化合物發(fā)生反應(yīng)，生成紅色化合物，培養(yǎng)基變紅色，是為V—P試驗(yàn)陽性，其他細(xì)菌不能生成乙酰甲基甲醇，培養(yǎng)基不變色，為陰性。 ④ 枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)(Utilization of citrate) 將細(xì)菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h。產(chǎn)氣桿菌等細(xì)菌能利用枸櫞酸鹽作為碳源，分解枸櫞酸鹽生成碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，培養(yǎng)基中的指示劑由淡綠色轉(zhuǎn)為深藍(lán)色，為枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陽性。大腸桿菌則不能分解枸櫞酸鹽，培養(yǎng)基顏色不變，為陰性。 3．硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)(Production of