沉淀技術ppt課件(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 適中的蛋白質濃度是 ％～ ％，相當于 25 mg/mL～ 30mg/mL。 蛋白質的濃度 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 22 第三章 沉淀技術 pH值對鹽析的影響 在等電點處溶解度小， pH值常選在該蛋白質的等電點附近。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 23 第三章 沉淀技術 溫度的影響 ? 對于蛋白質、酶和多肽等生物大分子，在高離子強度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。 ? 在低離子強度溶液或純水中蛋白質的溶解度大多數還是隨濃度升高而增加的。 ? 一般情況下，可在室溫下進行。但對于某些對溫度敏感的酶，要求在 0℃ ～ 4℃ 下操作，以避免活力喪失。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 24 第三章 沉淀技術 沉淀的再溶解 ?1～ 2倍沉淀體積的下一步所用緩沖液溶解 ?不溶時可能是變性蛋白質或雜質，離心除去。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 25 第三章 沉淀技術 脫鹽 透析 超濾 凝膠過濾層析 over Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 26 第三章 沉淀技術 ?有機溶劑 沉淀法 有機溶劑對于許多蛋白質（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質都能發生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一， 常用丙酮、異丙酮、乙醇、甲醇等 定義： 向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法，稱為有機溶劑沉淀法。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 27 第三章 沉淀技術 （ 1） 靜電作用 ： 降低水溶液的介電常數 ，向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質分子間的相互作用力，帶電的蛋白質溶質分子之間庫侖引力增強，使其相互吸引而聚集，導致蛋白質溶解度降低而沉淀。 原理 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 28 第三章 沉淀技術 （ 2）脫水作用 由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時從蛋白質分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質分子的水膜，因而發生沉淀作用。 較靜電作用占更主要的地位。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 29 第三章 沉淀技術 影響有機溶劑沉析的因素 （一）溫度 多數生物大分子如蛋白質、酶和核酸在有機溶劑中對溫度特別敏感，溫度稍高就會引起變性，且有機溶劑與水混合時產生放熱反應，因此必須 預冷 ，操作要在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須 緩慢且不斷攪拌 以免局部過濃。一般規律是溫度越低，得到的蛋白質活性越高。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 30 第三章 沉淀技術 （二）樣品濃度 ?樣品較稀時，將增加有機溶劑投入量和損耗； ?樣品太濃會增加共沉作用 。 ?一般認為蛋白質的初濃度以 ～ 2%（ 5 ~20mg/mL）為好，多糖則以 1～ 2％起始較合適。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 31 第三章 沉淀技術 （三） pH值 選擇在樣品穩定的 pH值范圍內，通常是選在等電點附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 32 第三章 沉淀技術 （四）離子強度 ?少量的中性鹽對蛋白質變性有良好的保護作用，但鹽濃度過高會增加蛋白質在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在 低濃度緩沖液中沉淀蛋白質 。 ?鹽濃度太大或太小都有不利影響， 通常鹽濃度以不超過 5%為宜，使用乙醇的量也以不超過原蛋白質水溶液的 2倍體積為宜 。 Anhui U