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疫化學(xué)技術(shù)ppt課件(編輯修改稿)

2026-05-28 18:10 本頁面

　

【文章內(nèi)容簡介】 A，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。脂類物質(zhì) 無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入 ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。優(yōu)點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。抗原用量少，僅為直接包被的 1/10乃至于 /100。包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。包被用抗體 IgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在 Fc段上，抗體結(jié)合點暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液 .須除去雜抗體后才能用于 ELISA，以保證試驗的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。包被的條件 pH78的 TrisHCL緩沖液。加入包被液后，在 48℃ 冰箱中放置過夜， 37℃ 中保溫 2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為 10ng/ml20ug/ml。封閉封閉 (blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥 ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑： %%的 BSA。 10%的小牛血清或 1%明膠。脫脂奶粉 ,比較價廉，可以高濃度使用（ 5%）。所有的 ELISA固相均需封閉？洗滌液在板式 ELISA中，常用的稀釋液為含 %吐溫20磷酸鹽緩沖液。 ELISA的試劑準(zhǔn)備 B 結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是 ELISA中關(guān)鍵的試劑 1 酶的催化活性 2 抗體（或抗原）的免疫活性 3 含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4 結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。 ? 結(jié)合物用的抗原和抗體制備結(jié)合物時所用純度較高的 IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應(yīng)，實驗結(jié)果本底淺淡。在 ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。 ? 酶純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。在 ELISA中， HRP， AP，葡萄糖氧化酶， β D半乳糖苷酶和脲酶等。 HRP是一種糖蛋白，含糖量約為 18%，分子量為 44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。 ? 結(jié)合物的制備酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。（ 1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá) 60%70%）和重復(fù)性好。交聯(lián)反應(yīng)是隨機的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。（ 2）過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成 chiff氏堿而結(jié)合。簡便有效 . 結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響 ELISA中最后的酶活性測定。但游離的抗體則會與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。 ? 結(jié)合物的保存酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（ HRP結(jié)合物加硫柳泵， AP結(jié)合物可加疊氮鈉）。 ? 結(jié)合物的稀釋液用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上： %牛血清白蛋白， %吐溫 20 。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在 48℃ 保存期可達(dá) 6個月。試劑準(zhǔn)備 C 酶的底物酶的底物 HRP的底物 OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是 HRP結(jié)合

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