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凝膠電泳ppt課件(編輯修改稿)

2026-05-29 12:02 本頁面

　

【文章內容簡介】室溫進行，PFGE一般應在 4℃ 進行。較高的溫度 DNA泳動較快；但是較高的溫度也引起較小片段的泳動截留和明顯的條帶變寬。種類 1) 按凝膠材料分 : 聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳 (普通瓊脂糖和低熔點瓊脂糖 ) 2) 按電泳裝置分 : 水平式 /瓊脂糖凝膠。豎式 /聚丙烯酰胺凝膠 3) 兩種方法比較：分離效果和分離范圍。操作難易 2. 用途瓊脂糖凝膠用于 DNA和 RNA的常規分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。 3. 凝膠電泳的一般程序制膠點樣電泳染色觀察 DNA電泳 1. DNA分子種類 1) 線狀 DNA— 單鏈與雙鏈， ssDNA電泳時要注意局部區域形成 dsDNA，造成遷移距離不確定 2) 環狀 DNA— 單鏈（如 M13mp）和雙鏈（質粒 DNA） 3) 線狀 dsDNA電泳 — 使用頻率最高的一種電泳這類 DNA分子在電泳過程中遷移的距離受以下幾個因素的影響： i. 分子量的大小 : 遷移距離與分子量的常用對數成反比 ii. 凝膠濃度 : 濃度越高，移動距離越短，適合分離低分子量DNA濃度越低，移動距離越長，適合分離高分子量 DNA : 低電壓時，遷移率與電壓成正比；電壓增高時，不同大小 DNA片段遷移率增大是不同的。 : 不受影響 ,溫度高可導致 DNA帶變形或解鏈。 4) 環狀 dsDNA電泳 : 常用于質粒 DNA的初步鑒定 5) 線狀 ssDNA電泳鏈分離凝膠：化學定序時，用于單鏈分離。 DNA雙鏈互補，但組成不一樣，仍可分離（機理不詳），電泳時形成三條帶：變性雙鏈，兩條單鏈。核酸定序凝膠 (染料指示劑 )：為避免局部區域產生二級結構，可采用各種變性措施，如煮沸樣品，提高電泳溫度，凝膠中加入變性劑（尿素、甲醛、甲胺等） RNA凝膠電泳方法：不同的 RNA電泳方法是依據使 RNA分子變性所采取的方法。這些方法不僅要使 RNA分子在點樣時是一級結構，而且在整個電泳過程中也保持一級結構。 1. 乙二醛 /二甲基亞砜法原理：乙二醛可以與核酸、核苷酸及堿基發生反應，特別是鳥苷形成一個穩定的附加環，從而阻止 GC堿基的互補作用發生步驟： RNA+10mM羥甲基醛和 50% DMSO混合 50℃ 、 1 h變性點樣電泳染色觀察 2. 羥甲基汞法原理：羥甲基汞可與 RNA分子的嘌呤或嘧啶堿基發生反應，反應部位是在可形成氫鍵的亞氨基處。步驟： RNA+10mM羥甲基醛點樣在含 4mM羥甲基醛的瓊脂糖凝膠上電泳染色觀察 3. 甲醛法步驟： RNA+ +50%甲胺點樣在含糖凝膠上 MOPS緩沖液電泳染色觀察其它變性劑，如尿素、甲胺等也可用于 RNA電泳 . 4. 三種方法的比較第一種方法安全，但由于反應是不可逆的，由此回收的 RNA樣品用于體外翻譯效果不好。第二、三種方法的反應可逆，回收RNA樣品可用于體外翻譯反應，但操作必須小心，因兩種變性劑有毒。蛋白質電泳方法：變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者常稱之為 SDSPAGE。差別：有無變性劑用途：非變性凝膠可用于蛋白質的分離純化過程中，可直接用于酶促反應（顏色變化） SDSPAGE可用于蛋白質分子量、亞基組成的測定。 mRNA翻譯產物，基因表達產物測定等。核酸片段的分離與回收 — 用于 DNA、 RNA以及蛋白質的回收 1) 電洗脫法 : 利用電泳方法將凝膠中的特定核酸分子到其它介質中； 2) 濾紙法 — 核酸凝膠染色長波紫外光確定位置在分離帶前方切一口子并插入濾紙條 (其背面覆蓋透析袋膜 ) 電泳至 DNA帶全部進入濾紙條洗脫 DNA 純化、沉淀 3) 透析袋法 — 切下含 DNA帶瓊脂塊放入透析袋，封口放入電泳槽電泳 2~3小時至全部 DNA離開凝膠塊反向電泳 1分鐘取出 DNA液純化、沉淀 4) 凍融法 5) 酶解法待回收 DNA 切口 DNA 切口凝膠塊濾紙法透析袋凝膠塊待回收 DNA 透析袋法待回收 DNA 凝膠塊 V型槽電洗脫槽法回收 DNA方法影響回收率的因素 1） DNA分子大小 — 回收率與分子量大小呈負相關； 2）乙醇沉淀 — 其中溫度、時間和 DNA濃度（回收時體積）均與回收率有關； 3）離心時間 — 時間越長，效果越好，對低濃度 DNA尤其明顯。回收 DNA片段質量凝膠材料的質量，如瓊脂糖中的硫酸鹽沉淀劑若改用精胺，它可有效地去除 PEG、核苷酸、鹽、聚丙烯酰胺及蛋白質等。二、基因擴增（ gene amplification） ? 主要內容： ? ? ，將目的基因在宿主細胞進行擴增 ? ，生物體內相關保衛基因的擴增。 ? ? 三、分子雜交

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