bdfacscalibur中文操作手冊cellquest軟件(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 探測器（電壓）。若必要，將這群細胞調在所有圖的左下角。 用于同型對照的抗體為小鼠 抗鑰 孔嘁血藍素（ KLH）。當用于測定人的細胞時，所發生的結合是非特異結合。 抗體的這種非特異結合現象是由于抗體的 Fc端與細胞膜上的 Fc受體結合。這和自發熒光 都是背景熒光。特定抗體 Fab端與細胞表面上特定抗原的特異結合所發的熒光為陽性熒光。 若必要，用同型對照管，在所有 熒光點圖上調節 FL1/2/3的電壓來調節背景熒光。 1．選擇點圖 2．在出現的對話框內選擇 X軸： FL1， Y軸： FL2 3．選擇 G1=R1 4．點擊 OK， FL1/FL2的點圖出現 5． 點擊 FL1/FL2點圖的邊框并將之拖至 FSC/SSC圖的右側 6．同樣建立一個 FL3/FL2的點圖，并選擇 G1=R1。如獲取 4色樣本，進行下一步。如獲 取 3色樣本，跳至第 8步。 7．同樣建立一個 FL3/FL4的點圖，并選擇 G1=R1。若無 FL4參數，請確認Detector/Amps 窗口中 Four color 前是否選中。 8．在工具板中選擇象限標尺 ,在 FL1/FL2點圖上 以同型對照管的門內細胞畫象限 , 這些象限指定了陰性 /陽性區域。 9．點擊 FL1/FL2點圖，拖動 Marker的柄將 它設定在 101處。 10．從 Status窗口選擇 Quadrant Stas（象限統計）。 11．在其余的圖上，重復 810步。 12．插上同型對照管 13．點擊 Aqusition Control窗口中的 Restart。 14．若必要，調節 FL FL2的電壓（在 Detector/Amps 窗口中），使這群細胞調在所有圖的左下角。 BD FACSCalibur 中文培訓手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 13 15．若必要，調節 FL3的電壓（在 Detector/Amps 窗口中），使這群細胞調在所有圖的左下角。 注意：勿調節 FL4的 PMT電壓，其電壓值有 FACSComp設定。 16．點擊 Aqusition Control窗口中的 Pause。 17．移去同型對照管。 18． 關閉 Detector/Amps 和 Threshold窗口 5． 6． 7 調節熒光補償 優化的最后一步是調節光譜重疊。若 3色樣本，必要時需調節 FL2%FL1， FL1%FL2，FL3%FL2， FL2%FL3的補償。若 4色樣本，必要時需也要調節 FL3%FL4， FL4%FL3 。 選擇適當的試劑用來調節補償很重要。 每種熒光素的補償應用染色最強的細胞群來 設置。如一個 Panel中有： CD3FITC、CD4FITC、 CD8FITC，則 FITC的補償應用 CD8FITC來設置。 補償的調節依賴于由同型對照管設定的探測器電壓。一旦電壓設定，補償用單陽性管調節。 1．從 Cytometer 菜單中選擇 Compensation 2．插上 CD3FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠 IgG1APC管。 3．點擊 Aqusition Control窗口中的 Restart。 4．若必要，調 節 FL2%FL1使 FITC+細胞在 FL1/FL2點圖的右下象限。 5．移去此管，插上小鼠 IgG1FITC/CD8PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠 IgG1APC管。 6．點擊 Aqusition Control窗口中的 Pause、 Restart。 7．若必要，調節 FL1%FL2使 PE+細胞在 FL1/FL2點圖的左上象限。 8．若必要，調節 FL3%FL2使 PE+細胞在 FL3/FL2點圖的左上象限 9．移去此管，插上小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP/小鼠 IgG1APC管。 10．查看 FL2%FL3的補償，應為 %,若必要，調節該補償。若作 3色，跳至 14 步。 11．查看 FL4%FL3的補償，應為 %,若必要，調節該補償。 12．移去此管，插上小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/CD4 APC管。 13．查看 FL3%FL4的補償，應為 %,若必要，調節該補償。 14．關閉 Compensation窗口。 15．點擊 Aqusition Control窗口中的 Pause、 Abort。 16．移去樣本管，插 上雙蒸水管。 17．將儀器處于 Standby狀態。 BD FACSCalibur 中文培訓手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 14 5． 7 實驗練習： 3色 /4色預獲取 在此練習中，您將： ? 設定 Acquisition（獲取）和 Storage（儲存）的條件。 ? 設定文件儲存參數 ? 創建試劑組合 5． 7． 1 設置 Acquisition amp。 Storage 窗口 在此窗口可設定獲取和儲存的顆粒數及類型。也可設定儲存的參數及其分辨率。 1．從 Acquire 菜單中選擇 Acquisition amp。 Storage，出現 Acquisition amp。 Storage窗口 2．在 Acquisition Gate 中選擇默認設置： Accept 、 All 獲取的數據首先由獲取的門處理，落在門內的所有顆粒被接受或放棄。然后數據按 Collection Criteria 窗口中的設置處理。 3．在 Collection Criteria中選擇默認設置： Event Count， 10000， All 可設置獲取終止的條件： Event Count：獲取的顆粒數 Time：獲取時間 4．在 Storage Gate中選擇默認設置： All 5．在 Resolution （分辨率）中選擇默認設置： 1024 6．點擊 Parameter Saved，出現對話框 7．若無第二根激光器，不選 P6（ FLXA）、 P7（ FLXW）。只有被選參數才儲存在 Data file中。若 3 色分析， FSCH、 SSCH、 FL1H、 FL2H、 FL3H需儲存。 BD FACSCalibur 中文培訓手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 15 8．點擊此對話框的 OK 9．點擊 Acquisition amp。 Storage窗口的 OK 5． 7． 2 設置 Parameter Description 1． 從 Acquire 菜單中選擇 Parameter Description，出現 Parameter Description對話框。 2．點擊 Folder，出現對話框，選擇或創建文件夾。 3．點擊此對話框的 Select “ ”。 4．點擊 Parameter Description對話框的 File ，出現文件名編輯窗口。 5．在 Custom Prefix中：輸入文件名 6．在 File Name Suffix中選擇 File Count 7．在 File Count 中：確認輸入的為 1 BD FACSCalibur 中文培訓手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 16 8．點擊此對話框的 OK 9．在 Parameter Description對話框中輸入您想保存的 Patient ID， Sample ID， Comments等信息。 10．選擇 或 輸入 所有參數名 選擇：點擊右側的箭頭，選擇已設定的參數名。 輸入：在 P1后的空格中輸入參數名。 11．將 Parameter Description對話框拖至適當位置以不妨礙視野，勿關閉。 5． 7． 3 編輯 Reagent Panel 編輯 Panel允許您 將所定義的試劑進行組合，以便為實驗的每管自動選擇參數名。可編輯 3色或 4色的 Panel。 3色 Panel： 小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP CD3FITC/CD16+56PE/CD45PerCP 4色 Panel： 小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP/小鼠 IgG1APC CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP/CD4APC CD3FITC/ CD16+56PE/CD45PerCP/CD19APC 1． 從 Acquire 菜單中選擇 Edit Panel，出現 Edit Panel對話框 2．點擊 Panel 上的 Add， new panel 就出現在 Panel list 中，輸入 panel 名 3．選擇該 panel（變黑），點擊 Tube 上的 Add， Tube1就出現在 tube list 中，輸入 tube 名 BD FACSCalibur 中文培訓手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 17 4．選擇該 tube（變黑），在 label lis