畢業論文水楊酸對鹽藻生長和物質積累的影響(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 蘿卜素，如八氫番茄紅素、番茄紅素、葉黃素、玉米黃質等。這些類胡蘿卜素已廣泛應用于食品、化妝品及醫藥領域。（2） 生產高營養藻粉杜氏鹽藻干粉富含優質蛋白質、脂肪酸，以及豐富的類胡蘿卜素，無難消化的細胞壁，因而是優質的家禽和水產養殖飼料。杜氏鹽藻干粉含40%左右的蛋白質，且蛋白質的氨基酸組成與大豆相似富含賴氨酸，僅含少量的半胱氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸和色氨酸。與其他單細胞來源(如酵母和細菌)的蛋白粉相比，杜氏鹽藻干粉中的核酸 (DNA和RNA)含量很低。由于核酸有毒副作用，因此這也是杜氏鹽藻干粉受市場歡迎的一個重要原因。（3）生產甘油和生物制品甘油是一種重要的商業有機化合物和滲透調節物，被廣泛應用于化妝品、醫藥和食品等領域。目前甘油的主要來源是石油，隨著石油資源的日益減少， 開發新的甘油來源具有重要的戰略意義。杜氏鹽藻富含甘油，在特定養殖條件下， 其含量可達干重的50%， 因此是甘油生產的潛在資源。除甘油外， 杜氏藻還是大規模生產其他重要生物制品的潛在物種，由于杜氏藻易培養、不易污染、外源蛋白的表達與純化方便，使得生產外源蛋白的成本明顯低于其他系統(如大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞等)，作為一種新型生物反應器，已呈現出巨大的應用前景。（4）提高植物耐鹽性杜氏藻是已知真核生物中最耐鹽的生物，能在35%飽和鹽溶液中生存。其耐鹽機制被認為是通過調節自身細胞內甘油濃度來實現的。當杜氏藻在高鹽環境中生長時，細胞內的甘油含量將超過50%，以此補償細胞內外的滲透壓差，同時為酶提供“合適的溶質”以防止酶失活或受到抑制。但杜氏藻的耐鹽機制十分復雜，到目前為止遠未完全清楚，有待進一步研究。杜氏藻耐鹽機制的闡明及耐鹽基因的克隆，將對提高高等植物的耐鹽性、擴大和提高農作物的種植范圍和產量、緩解世界糧食危機，具有不可估量的意義。（5）廢水處理廢水處理包括3個層次：初級處理、二級處理和三級處理。其中二級處理是利用微生物對各種有機物進行生物降解。在此階段，杜氏藻與其他微生物共生， 可促進微生物的生長，同時杜氏藻消耗微生物分解產生的氮、磷和CO2等無機物，提供微生物需要的O2。研究顯示，特氏杜氏藻中的金屬結合肽和植物螯合肽可將無機砷代謝成砷聚合物，從而達到去除環境中重金屬的目的。（6）環境指示相對其他測試生物(如動物)而言，藻類對生活污水或工業廢水有更高的敏感性。利用藻類來指示環境毒性的研究，最近有很多報道。Santin Montanya等報道了七種微藻對海洋環境殺蟲劑的測試方法，指出普氏杜氏藻是禾草滅、稀禾定、苯嗪草酮、二氯吡啶酸等殺蟲劑的最佳指示劑。黃小娟等[24]利用杜氏藻生長阻礙實驗，測定排放到環境中特別是飲用水中的有機毒物，從而得知被測化合物的生物毒性。這種行之有效的測試飲用水污染的方法，在水質污染監測和控制方面有著廣闊的應用前景 外源激素水楊酸與杜氏鹽藻的β胡蘿卜積累 水楊酸的性質1976英國的Edmund stone首先發現柳枝皮可以治療瘧疾和鎮痛解熱，1828年德國John Buchner從柳樹皮中分離出少量的水楊苷（Salicin）1838年Piria將柳樹皮中這種活躍的有效成分命名為水楊酸( Salicylic Acid，簡稱SA)；1874年首次合成水楊酸，水楊酸的化學名稱為鄰羥基苯甲酸。水楊酸是一種植物體內產生的簡單酚類化合物，廣泛存在于高等植物中。純品是一種帶狀態結晶或輕質的結晶性粉末，化學式為C6H4(OH)(COOH)。水楊酸易溶于乙醇、乙醚、氯仿、苯、丙酮、松節油，不易溶于水，20℃。水楊酸在植物界中普遍存在，一般較多分布在產熱植物的花序。據報道，水稻、大麥等34種主要農作物的葉片和繁殖器官中都含有水楊酸，在不同植物及同一植物的不同組織內含有的水楊酸的含量不同，通常含量較低，在產熱植物花序和受病原物侵染的植物中組織中含量較高。水楊酸是肉桂酸的衍生物，在植物體內合成，一般認為是通過莽草酸先形成肉桂酸，然后經過兩條途徑生成水楊酸：一種是肉桂酸先經過β氧化產生苯甲酸，在經過羥化即產生水楊酸；另一種是肉桂酸先經過羥基化產生鄰香豆酸，再經β氧化產生水楊酸。 水楊酸的生理作用（1）抗病作用水楊酸在植物抗病性中的作用是目前研究最深入的，水楊酸在植物的抗病反應中主要起信號分子的作用，是植物產生過敏反應(HR)和系統獲得性抗性(SAR)所必需的物質。1979年White首先發現外源水楊酸及其衍生物乙酰水楊酸處理煙草可誘導病程相關蛋白的合成和對煙草花葉病毒的抗性。以后的研究進一步表明，外源SA可誘導番茄、黃瓜、水稻、大蒜、大豆、甜菜、擬南芥等植物對真菌、細菌、病毒等病原菌的抗性。水楊酸誘抗作用的發現為今后研制新型誘抗劑，減少有害農藥的使用提供了新的思路和途徑，因而倍受人們的關注。（2）誘導開花1965年Lee和Skoog發現SA可誘導煙草組培植株開花，1974年Cleland和Ajami 鑒定誘導短日植物開花的物質是水楊酸；外施水楊酸于浮萍科植物可誘導或促進開花。水楊酸與蔗糖混合施用可促進文心蘭開花，水楊酸、赤霉素和β萘酚誘導短日植物鳳仙花在長日照下形成花芽。現在對水楊酸誘導植物開花的機理仍不十分清楚, 有一種假說認為是水楊酸起螫合劑作用[ 25]。（3）提高植物抗環境脅迫能力近年來的研究表明，水楊酸在植物抗冷、熱、干旱、鹽、臭氧、重金屬等環境脅迫方面有明顯的作用。在馬鈴薯等產熱植物上，水楊酸可促進線粒體交替呼吸途徑，增加產熱量，提高馬鈴薯的抗冷性。Yalpani等發現煙草受到熱脅迫時其內源SA水平升高。%的NaCl脅迫下，、發芽指數和活力指數，提高幼苗體內SOD、CAT等細胞保護酶的活性，抑制了MDA的積累，提高了小麥幼苗葉片對鹽脅迫的適應性。有人提出，在鹽脅迫條件下，外源SA能夠顯著提高Na+向下運輸的選擇性而增強K+向上運輸的選擇性,因此,能顯著提高植物體的抗鹽性。此外,SA還與臭氧、重金屬脅迫等有關。（4）生熱效應天南星科植物佛焰花序的生熱現象很早就被認識到了，直到1987年Raskin 等試驗證明，引起生熱的物質就是水楊酸。正如Voodoo百合雄花的提取液一樣，外源施用SA也可以使成熟花上部佛焰花序的溫度提高。SA能夠產熱的原因被認為是由于其可增加植物抗氰呼吸，抗氰呼吸電子傳遞系統產生的能量多以熱的形式釋放出來，而不主要合成化學能；用抗氰呼吸抑制劑處理，放熱就減少；SA對非產熱植物的抗氰呼吸也有誘導作用。 水楊酸的應用1763 年英國的Edmund Stone首先發現柳樹皮有很強的收斂作用，可以治療瘧疾和發燒，后來研究證明水楊酸在植物界普遍存在，作為一種植物內源信號分子，對植物的許多生理過程如植物開花、產熱、種子發芽、氣孔關閉、膜通透性及離子的吸收等起調控作用，一些科學家認為應該將之作為一種新的植物激素來看待。有關水楊酸與植物抗逆的研究始于20世紀70年代，研究發現：SA與植物抗病之間存在著莫大的關聯，SA應用于植物抗生物脅迫的研究逐漸成為植物抗逆性研究的熱點。近十多年來，關于SA對植物抗病性的誘導及其作用機制、SA信號轉導途徑等方面的研究也已取得重大進展。此外，SA用于植物抵抗非生物脅迫(重金屬、臭氧、紫外輻射、高溫、低溫、干旱、鹽漬等逆境)的研究也開始受到廣泛關注。現已證明：水楊酸不僅可以調節植物的某些生長發育過程，還能誘導植物產生抗逆性，抵抗不良因素造成的傷害。 水楊酸與β胡蘿卜素近年來，國內外對杜氏鹽藻的培養條件和β胡蘿卜素的誘導條件進行了大量的研究，研究發現鹽藻的最適生長條件和β胡蘿卜素最適積累條件存在很大的差異，一般在高鹽度、強光、營養饑餓等條件下，鹽藻能夠大量積累β胡蘿卜素，但此條件下不適于鹽藻的生長；而在最適的生長條件下，β胡蘿卜素又無法大量的積累。為了解決這一矛盾，周世水等進行了二步法培養的研究，即在鹽藻的生長階段和β胡蘿卜素的積累階段采用不同的培養方法，以獲得最大的β胡蘿卜素產量。目前，對利用鹽藻生產β胡蘿卜素的研究主要集中于外界條件這一層次上，如鹽度、光照強度、溫度、營養液等。而外源激素水楊酸對鹽藻β胡蘿卜素積累研究很少。水楊酸作為一種植物激素，主要的研究集中于高等植物。本文初步研究了不同濃度的水楊酸對鹽藻生長和物質積累的影響。實驗結果表明在一定范圍內，低濃度（1mg/L）的水楊酸對鹽藻的生長具有一定的促進作用；高濃度（5mg/L、10mg/L）的水楊酸前期對細胞的生長具有一定的促進作用，后期具有明顯的致死作用。在一定范圍內。較低濃度的水楊酸對色素的積累具有一定的促進作用，本實驗中1mg/L的水楊酸促進作用最明顯，可以明顯加快色素的積累進程。在色素積累過程中，鹽藻總可溶性蛋白含量的變化規律與藻細胞生長趨勢基本保持一致。第二章 材料與方法第二章 材料與方法 杜氏鹽藻的培養 藻種 杜氏鹽藻原藻種購自中國海洋大學 藻種培養在5L三角瓶內裝3L液體培養基，接種一定體積的原藻液，且接種細胞為分裂能力較強的綠色游動細胞。由日光燈提供照明，12h/12h光暗周期照明，光強為1000Lx，恒溫下培養，培養溫度為20℃。每天搖動培養瓶35次，直至培養到生長對數期。后繼續轉移到250mL的培養瓶中進一步擴增，其中移入的液體培養基為80mL，藻液為20mL，總體積為100mL。隨著藻細胞密度的增大，搖瓶次數增加到58次。以防止藻細胞貼壁生長，以培養出較多量的綠色游動細胞進行進一步的實驗。本實驗采用 MCM培養基，其中各營養成分濃度如下：（一）大量元素：KNO3 NaCL 150g/L（二）微量元素H3BO3 5H2O 60μg/LCoCL6H2O 51μg/L MnCL24H2O 41μg/L(NH4)6Mo7O244H2O （三）螯合鐵溶液Na2EDTA FeCL36H2O 實驗材料 藥品與試劑 水楊酸、牛血清白蛋白、蒸餾水、95%乙醇、丙酮、飽和食鹽水、85%濃磷酸 PH PBS：25mL KH2PO4+ NaOH 加水稀釋定容至100mL考馬斯亮藍G250：稱取100mg考馬斯亮藍G250溶于50mL90%乙醇中，加入85%濃磷酸100mL，最后用蒸餾水定容至1000mL。常溫下可保存一月 儀器 冰箱、血球計數板、三角瓶（250mL、4L）、比色皿、量筒、容量瓶、膠頭滴管、蓋玻片、細線、封口膜、pH試紙、玻璃棒、藥匙、移液槍等電子天平（HANGPING FA1004）可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司723型）超聲波破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司 CV33）超速離心機（TGL—16G）臺式高速冷凍離心機（HERMLE Z323K）臺式低速離心機（北京醫用離心機廠 LG10—）高壓蒸汽滅菌鍋超凈工作臺（DL—CJ—IN）普通光學顯微鏡（SE