耐低溫菊粉酶產生菌的分離及發酵條件的優化研究畢業論文(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 提高了 4 倍；I/S 為 880，是野生菌的 16 倍 [9]。 不同條件對微生物合成菊粉酶的影響(1)碳源的影響菊粉酶通常認為是一種誘導酶。大多數的研究結果一致認為，以菊粉作為碳源比以其它糖作碳源產菊粉酶活力高，且不同碳源對野生菌株和誘變菌株的影響不同。Thonart研究發現葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘油、乙醇對經 NTG 誘變過的菌株有誘導作用，而對野生菌株無誘導作用 [9]。Fontana 等人用菊粉的衍生物己酸化菊粉和膽固醇菊粉作碳源，發現己酸化菊粉是最好的誘導物，其酶活比用菊粉作誘導物提高了 419816 倍 [10]。這可能是山于己酸化菊粉不僅是更有效的誘導物，而且菊粉上的輕基被酷化后連接上的脂肪鏈有表而活性劑的作用，使得誘導物更易聚集在細胞壁上，從而改變了細胞壁的穿透能力，增加了對誘導物的吸收。Gupta 等人發現用從菊芋根中提取出來的果聚糖作碳源(開花前含很少量的葡萄糖和果糖)，比用菊粉作碳源，酶活力有很大提高 [9]。也有人認為菊粉酶是組成型酶，當馬克斯克魯維酵母()在以甘油作為唯一碳源的培養基上生長時也產菊粉酶。(2)氮源的影響在不同的培養條件下，對于不同菌株，氮源的影響也不同。Gupta 等人研究了不同氮源對克魯維酵母(Kluyveromyces waltii)產菊粉酶的影響，發現以蛋白胨作氮源時產菊粉酶活力最高 [7]。Kin 等人研究了各種無機氮源對青霉菌(Penicillium)產菊粉酶的影響，蛋白胨和玉米漿作氮源能提高產酶量，而脲和酵母膏影響不大 [22]。在無機氮源中，以(NH 4)2HPO4和（NH 4)H2PO4 作氮源產酶量最高，(NH 4)2SO4，NH 4C1，NH 4NO3 和 KNO3 也能促進產酶量提高 [6]。(3)無機磷源的影響在培養基中加入磷源 NaH2PO4 %和 KH2PO4 %，產酶活力比不加磷源高 [6]。(4)不同金屬離子和微量元素的影響Kim 和 Nakamura 等人發現在培養基中添加 FeS04， 4， 能使青霉菌(Penicillium )和黑曲霉() 的產酶量分別提高 32%，26%，12% [3]。(5)溫度的影響克魯斯假絲酵母(Candidacrusei) 產酶的最適溫度為 2730℃，溫度提高將導致產酶量降低。克魯維酵母(Kluyveromyces waltii)產酶的最適溫度為 3040℃[21]。真菌達到最大生長量和最高酶活的溫度范圍為 2734℃，如黑曲霉(Aspergillus niger) 的最適產酶溫度為 30℃，青霉菌(Penici1lium )為 3033℃[12]。 菊粉酶的分布不同菌種菊粉酶的分布不一樣，Rottweatlioist 等人報道酵母有 50%酶在胞外。Margaruttes 報道酵母有 25%的酶在胞外，75% 在胞壁和胞內 [11]。培養條件也影響菊粉酶的分布，對于克魯維酵母(Kluyveromyces waltii)以 pH 影響最大，低 pH 高溫下有利于菊粉酶釋放于胞外，pH ,35℃下培養時，胞外有菊粉酶。而 pH 時胞外無菊粉酶 [20]。對于馬克斯克魯維酵母(K .Marxianus)以玉米漿和菊粉作培養基時，胞外酶最多，而以酵母膏和菊粉作培養基時胞內酶最多，隨著培養溫度的提高胞外酶的比例下降胞壁酶和胞內酶的比例上升 [9]。 菊粉酶的純化對于混合酶，酶的純化步驟一般分為:(NH) 2SO4 沉淀、離子交換層析及凝膠過濾色譜等。離子交換層析可用來選擇性地分離外切型菊粉酶和內切型菊粉酶，通常用 NaCl 進行線性梯度洗脫，隨著 NaCl 濃度增加，內切菊粉酶先洗出，外切酶后洗出。有些微生物菊粉酶不宜用(NH) 2SO4 沉淀如 var 菊粉酶用(NH) 2SO4 沉淀易失活，最好用丙酮、乙醇沉淀或冷凍干燥 [14]。Pessoa 等人研究了酵母胞外菊粉酶的純化，在離子色譜柱上，對于弱陰離子交換劑 DEAE，最佳吸附 pH 為 ，對于強陰離子交換劑，最佳吸附pH 為 [19]。 菊粉酶為糖蛋白，含糖量為 26%37%，低聚糖以糖苷鍵的形式與酶蛋白中的天門冬酰胺殘基相連，純化后的菊粉酶在 SDSPAGE 和活性電泳中表現出幾條譜帶是出于各組分含糖量不同所造成的，用 EndoH 去除酶蛋白中的糖后，在電泳中得到單一譜帶 [13]。 菊粉酶的性質不同菌種所產菊粉酶的性質有所不同。無花果曲霉() 菊粉酶經純化得到三種酶 :外切酶 I、外切酶 II 和內切酶 I，三種酶分子量分別為 42,900Da、43,400Da 、47,200Da 。外切酶 I 和外切酶 II 以菊粉和蔗糖作為底物時，其最適反應溫度分別為 60℃和 65℃,最適 pH 均為 ；降解菊粉所需最低活化能分別為 2211kJ/mol 和 3319kJ/mol；降解蔗糖所需要低活化能分別為 2217kJ/mol 和2815kJ/mol；內切酶 I 降解菊粉所需最低活化能為 1mmol/L[16]。外切酶水解蔗糖的活力與轉化酶相同，內切酶兒乎不水解蔗糖，Hg 2+、Ag +、Mn +強烈抑制酶活，說明酶活性中心有SH 基因， Ca2+使酶活增加，吲哚乙酸、EDTA ,磷酸毗哆醇對酶活沒有顯著影響 [9]。黑曲霉() 內切菊粉酶分子量 ，只水解菊粉不水解蔗糖，最適溫度為45℃， 40℃以下穩定， 50℃以上開始失活，80℃時完全失活，最適 pH ，pH 時酶活為 100%pH 時酶活為 76%，pH 時酶活為 51%，pH 時酶完全失活 [5]。外切酶的反應機理為單鏈反應，以菊粉為底物，以葡萄糖的生成速度、果糖與葡萄糖之比的變化速度為依據來判斷，水解反應一般為單鏈反應，即一次只水解一條鏈；pH對此作用機制有影響， 時，較多地傾向于多鏈反應， pH 時為單鏈反應 [18]。 研究的目的意義我國在菊粉酶研究和應用中的主要困難：產酶成本高，導致應用成本高。因此本研究針對這一問題，對耐低溫菊粉酶產生菌進行高產菌株的分離，并針對分離菌種產菊粉酶的發酵條件進行優化研究，以期能夠得到低溫下即可分泌菊粉酶的高產菌株，實現菊粉酶的工業應用普及。2 材料與方法 樣品 腐爛的菊芋，保藏于生化實驗室 4℃的冷柜中； 培養基(1)斜面保藏培養基：牛肉膏 %，蛋白胨 1%，氯化鈉 %，瓊脂 %，pH 調至；(2)分離培養及：(NH 4)2SO4 %，MgSO 47H2O %，K 2HPO4 %，菊粉 %，瓊脂 %， ；(3)初篩培養基：同分離培養基；(4)復篩培養基：(NH 4)2SO4 %，K 2HPO4 %，酵母膏 %，菊粉 %，pH ；(5)種子培養基：同復篩培養基配方 主要試劑表 21 主要試劑表Table 21 The Main reagent list藥品名稱 品級 制造商菊粉 食品級 廣州澤鈺生物科技有限公司豆粕 食品級 阜新維遠食品科技有限公司磷酸氫二鉀 分析純 沈陽市東興試劑廠硫酸鎂 分析純 沈陽市新西試劑廠硫酸銨 分析純 沈陽市新西試劑廠氯化鈣 分析純 國藥集團藥業股份有限公司氯化鉀 分析純 國藥集團藥業股份有限公司氯化鈉 分析純 國藥集團藥業股份有限公司氫氧化鈉 分析純 天津市大茂化學試劑廠無水硫酸鈉 分析純 國藥集團藥業股份有限公司苯酚 分析純 國藥集團藥業股份有限公司酒石酸鉀鈉 分析純 國藥集團藥業股份有限公司3,5二硝基水楊酸 分析純 國藥集團藥業股份有限公司冰醋酸 分析純 國藥集團藥業股份有限公司吐溫80 生化試劑 國藥集團藥業股份有限公司D果糖 生化試劑 國藥集團藥業股份有限公司 主要儀器設備表 22 主要儀器設備表Table 22 The main instrument equipment list酵母膏 生化試劑 國藥集團藥業股份有限公司蛋白胨 生化試劑 國藥集團藥業股份有限公司牛肉膏 生化試劑 國藥集團藥業股份有限公司瓊脂 生化試劑 國藥集團藥業股份有限公司名稱 型號 制造商精密 PH 計 PHS3C 型 上海精密科學儀器有限公司電子分析天平 FA2104N 上海精密科學儀器有限公司高速冷凍離心機 KDC160HR 上海精宏實驗設備有限公司振蕩培養箱 BS2F 上海精宏實驗設備有限公司恒溫培養箱 DNP9052 型 上海精宏實驗設備有限公司數顯鼓風干燥箱 GZX9070MBE 上海博迅實業有限公司超凈工作臺 SWCJ2F1D 上海博迅實業有限公司醫療 設備廠冰箱 BCD201Q 上海科隆電器紫外可見分光光度計 UV752 上海欣茂儀器有限公司恒溫水油浴鍋 MF5000 鞏義市予華儀器有限責任公 司電爐 JYC19BE2 山東九陽小家電有限公司電磁爐 JYC19BE2 山東九陽小家電有限公司 技術路線及操作要點 技術路線 圖 21 技術路線圖Figure 21 technology roadmap 操作要點(1)采樣菌源來自于實驗室一盆低溫保存的腐爛菊芋，采樣時要各個部位（垂直方向到水平方向）都采集到，至少做到垂直方向上中下三層，水平方向八個方位，以保證菌種采集充分，為下一步篩選高產菌株做準備；采集后的樣品于玻璃瓶內 4℃冰箱低溫保藏（共 24瓶） 。(2)菌種分離從保藏的樣品中適量挑取約 1g 放入盛 99mL 無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，震搖至少 20 分鐘，待其完全混合，細胞分散開后，用一支 1mL 無菌吸管從中吸取 1mL 樣品溶液加入事先準備好的內盛 9mL 無菌水的大試管中，充分混合；然后用無菌吸管從此試管中吸取 1mL 加入另一事先預備好的內盛 9mL 無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成 103,104,105,106,107,108 不同稀釋度的樣品稀釋液，通過初步菌種分離選出最適稀釋度；按分離培養基配方制作好三份平板，分別標記 （每份平板準備 3 個，即A1A2A3，B 1B2B3，C 1C2C3 共 9 個，下小標表示三個最適稀釋濃度）倒置放置；A取上層醫用高壓蒸汽滅菌鍋 EST056 錦州科學儀器醫療設備廠樣品，B取中層樣品，C取下層樣品；用無菌吸管分別從上述 103 至 108 樣品稀釋液中各吸取 或 小心的滴于準備好