玉米蛋白資源高效利用開發(fā)抗氧化肽的關(guān)鍵技術(shù)研究畢業(yè)論文(編輯修改稿)

　

【文章內(nèi)容簡介】 改良淀粉和蛋白質(zhì)特性是玉米蛋白粉精深加工的主要研究問題。 玉米蛋白粉的營養(yǎng)價值玉米蛋白粉中的蛋白質(zhì)主要為醇溶蛋白和谷物蛋白，另有少量的球蛋白和白蛋白 [7]。醇溶蛋白可溶于 70 % 80 %的乙醇，谷蛋白可溶于稀酸或稀堿，球蛋白不溶于水但溶于鹽，白蛋白又稱清蛋白，可溶于水 [8]。玉米蛋白粉水解后可分解得到谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和丙氨酸等 [9]，其中亮氨酸和谷氨酸的含量較多，賴氨酸和色氨酸含量較低，其他幾種必需氨基酸含量也較低。由于這種獨特的氨基酸組成，造成玉米蛋白粉的營養(yǎng)價值不高，但是通過生物工程和化學技術(shù)可以對玉米蛋白粉進行二次利用。目前的研究第 1 章 緒論 2熱點在于，控制酶解技術(shù)可獲得具備多種生理功能的玉米源活性肽。 玉米蛋白粉的應(yīng)用現(xiàn)狀（1）用作飼料蛋白原料玉米蛋白粉不含有毒有害物質(zhì)，可以直接作為飼料蛋白原料。玉米蛋白粉飼料可替代豆餅和菜粕，通常作為家禽配合飼料的主要組分。飼喂玉米蛋白粉的蛋雞產(chǎn)蛋率可提高 15 %左右，能夠防治蛋雞的軟骨病和其他疾病，有助于提高蛋白品質(zhì)。用玉米蛋白粉飼喂牛，可以使在瘤胃中不易被消化的蛋白質(zhì)能在小腸中被更好地吸收 [10]。（2）制備谷氨酰胺肽谷氨酰胺是一種氨基酸類藥物，可用于治療胃腸性疾病和免疫性疾病。研究人員發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺一般聚集于玉米醇溶蛋白，而玉米蛋白主要由醇溶蛋白構(gòu)成，所以可由玉米蛋白粉制得谷氨酰胺肽。當機體內(nèi)谷氨酰胺含量不足時，可以通過體外的谷氨酰胺肽進行補給，利用低價值的玉米蛋白粉制備高價值的谷氨酰胺肽是玉米蛋白粉深加工一條新途徑 [11]。（3）制備玉米醇溶蛋白研究發(fā)現(xiàn)，玉米醇溶蛋白具有獨特的溶解性、成模性和生物活性，可用于防潮、抗氧化、保鮮、防靜電等。利用成膜性，玉米醇溶蛋白還可作為藥物制劑的輔料。近年來有研究報道，玉米醇溶蛋白的制備方法已經(jīng)由過去的異丙醇提取法發(fā)展為乙醇提取法。也有研究應(yīng)用超聲波技術(shù)和萃取技術(shù)，并優(yōu)化獲得醇溶蛋白的提取工藝，可以提高生產(chǎn)效率 [12]。（4）制備玉米黃色素玉米蛋白粉經(jīng)水解、萃取、蒸發(fā)濃縮等操作能夠制備玉米黃色素。適宜的蛋白酶水解條件和酶解物處理能夠提高玉米黃色素得率，增效劑的配合使用能夠影響玉米黃色素的光密度值 [13]。段純明等研究了通過擠壓膨化技術(shù)處理玉米蛋白粉可以提高玉米黃色素的提取率 [14]。而且玉米蛋白粉的酶解溫度、水解時間和 pH 值也會影響玉米黃色素的提取率 [15]。（5）制備玉米蛋白肽近期研究發(fā)現(xiàn)，玉米蛋白粉可用以制備高 F 值低聚肽、降血壓肽和抗氧化肽等蛋白肽。高 F 值低聚肽的消化吸收性優(yōu)于蛋白質(zhì)與氨基酸，可以作為腸道營養(yǎng)劑。隨著相關(guān)研究的逐步深入，高 F 值低聚肽的生產(chǎn)與應(yīng)用為玉米蛋白粉的精深加工開辟了新方向。第 1 章 緒論 3玉米蛋白粉具有獨特的氨基酸組成，能夠滿足血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制肽的氨基酸特征，可制備獲得降血壓肽 [16,17]。何慧等研究報道，玉米大豆復(fù)配蛋白可以制備獲得降血壓肽，而且中性蛋白酶是酶解蛋白的最適宜酶 [18]。國內(nèi)外研究表明，玉米源抗氧化肽的活性受酶解條件、蛋白酶種類和底物特性的影響較大。有研究證實，玉米抗氧化肽的活性測定方法較為普遍，多數(shù)以自由基清除率為考察指標 [19]。王雙玉研究報道，底物濃度為 8 %，[E]/[S]為 2 %，pH 值為 ，時間為 3 h，溫度為 55 ℃時，玉米抗氧化肽對氧自由基（O 2?）和羥自由基（? OH）具有很強的清除能力 [20]。第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選4第 2 章 高效水解玉米蛋白粉的關(guān)鍵技術(shù)研究在高效水解玉米蛋白粉的關(guān)鍵技術(shù)研究中，以水解度（DH）為衡量指標，將借助單因素實驗和響應(yīng)面實驗設(shè)計等研究方法，對比分析堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶 3 種蛋白酶對玉米蛋白粉酶解過程中的 DH 的影響情況，獲得高水解度玉米蛋白酶解物的最佳工藝參數(shù)；在此基礎(chǔ)上，本文將首次開展電子束輻照技術(shù)對玉米蛋白粉酶解效果的研究，重點分析不同輻照劑量（ kGy）處理玉米蛋白粉后對其水解度的影響，擬設(shè)計一條水解度為 40 %以上的玉米蛋白粉酶解技術(shù)的工藝路線，為后期玉米蛋白粉的綜合利用開發(fā)功能肽提供技術(shù)支撐。 材料與設(shè)備 材料與試劑玉米蛋白粉（經(jīng) 180 目篩選，蛋白質(zhì)含量 %）：購買于長春大成集團；1,1二苯基 2三硝基苯肼（1,1diphenyl2picrylhydrazyl, DPPH）：分析純，購買于Sigma 公司；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶（酶活 20 萬 U/g）：食品級，購買于南寧龐博生物工程有限公司；甲醇、氫氧化鈉、鹽酸：均為分析純，購買于北京化工廠。 儀器與設(shè)備ESJ604 電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；DK8D 恒溫水浴槽：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Starter300 便攜式 pH 計：上海奧豪斯儀器有限公司；JJ1 型精密增力電動攪拌器：金壇榮華儀器制造有限公司；單道移液器（200 μL，1000 μL ）：北京東林昌盛生物科技有限公司；CR20B2 型離心機：日本日立工機公司；MH2 型微量振蕩器：江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；RT6000 酶標儀：美國雷杜公司；第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選510Mev/15KW 輻照電子直線加速器：長春易孚輻照加速器有限公司；JSM6700F 場發(fā)射掃描電子顯微鏡： JEOL 日本電子公司。 實驗方法 玉米蛋白粉的酶解方法 水解度測定方法水解度（DH）是衡量水解反應(yīng)中，蛋白質(zhì)水解達到平衡后肽鍵被酶切斷的情況，通過測定水解度可以優(yōu)選最適宜蛋白酶和最佳酶解條件。測定方法采用 pHstat 法 [50,51]，pHstat 法較甲醛滴定法操作簡單方便，實驗結(jié)果準確性高 [52]。底物蛋白在不同 pH 環(huán)境下解離狀態(tài)不同，酶解后可以產(chǎn)生自由羧基、氨基和氨基酸殘基，所釋放的氨基酸能改變酶解液 pH 值，用 1M 的 NaOH 或 HCl 滴定回原 pH 值，根據(jù)計量消耗的酸液或堿液體積，即可知道肽鍵被酶切斷的數(shù)目，計算得到單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中被酶解的肽鍵數(shù)占總肽鍵數(shù)的百分比即為水解度 [53]，計算公式如下： …………………………（公式 ） ；toptohV CDH (%)= 10Mhα???????? ?式中：h—被水解的肽鍵數(shù)；V—酸或堿的滴定量 (mL)；C—酸或堿的濃度 (mol/L)；Mp—參加水解的蛋白質(zhì)總量 (g)；htot—每克蛋白質(zhì)中肽鍵的克當量數(shù)（對于玉米蛋白取 mmol/g） ；α—氨基酸的平均離解度。 蛋白酶可控酶解技術(shù)的單因素實驗設(shè)計為了篩選玉米蛋白酶解技術(shù)的最優(yōu)蛋白酶，選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶分別酶解玉米蛋白粉。由于酶解溫度、pH 值和酶與底物濃度比三個因素對酶解效果和產(chǎn)物的影響較為顯著 [54]。因此，依次考察了酶解溫度（T） 、酶解 pH 值、酶與底物濃第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選6度比（[E]/[S]）對玉米蛋白粉 DH 的影響，單因素實驗設(shè)計方案如表 所示：表 單因素實驗設(shè)計表Table Design of Onefactoratatime experiment水平酶種類 因素1 2 3 4 5 6酶解溫度（℃） 40 45 50 55 60 65酶解 pH 值 6 7 8 9 10 11堿性蛋白酶[E]/[S]（%） 2 4 6 8 10 12酶解溫度（℃） 25 30 35 40 45 50酶解 pH 值 5 6 7 [E]/[S]（%） 2 4 6 8 10 12酶解溫度（℃） 40 45 50 55 60 65酶解 pH 值 4 5 6 7 8 9木瓜蛋白酶[E]/[S]（%） 2 4 6 8 10 12 蛋白酶可控酶解技術(shù)的響應(yīng)面實驗設(shè)計利用響應(yīng)面軟件 DesignExpert 中的 BBD 實驗設(shè)計進行優(yōu)化分析。根據(jù)單因素實驗結(jié)果和 BBD 中心組合實驗原理，為最優(yōu)蛋白酶設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化實驗 [55]。建立二次回歸模型，用不失擬的回歸方程確定最優(yōu)工藝參數(shù)，決定最優(yōu)響應(yīng)因子水平 [56]。自變量 X1（酶解溫度） 、X 2（酶解 pH 值） 、X 3（[E]/[S]）的三個水平編碼表如表 ，回歸方程的二次模型如下： 33230111jj ijjijy?????????式中：y 是響應(yīng)值； β0是截距， βj、β jj和 βij分別代表線性、平方和交互作用系數(shù)；X i和 Xj代表自變量。第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選7表 響應(yīng)面實驗因素水平表Table Factors and levels of RSM編碼水平因素 編碼1 0 1酶解溫度（℃） X1 50 55 60酶解 pH 值 X2 8 9 10[E]/[S]（% ） X3 8 9 10 電子束輻照技術(shù)對玉米蛋白粉水解度的影響以玉米蛋白粉為原料，分別經(jīng) 0 kGy 、 kGy、 kGy、 kGy、 kGy、 kGy 和 kGy 8 個輻照劑量進行電子束輻照處理，依次在適宜蛋白酶的最佳酶解條件下進行可控酶解處理，以 DH 作為衡量指標，檢測不同輻照劑量對玉米蛋白粉水解度的影響。 場發(fā)射電子掃描實驗利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（JSM6700F ，JEOL 日本電子公司）對輻照處理前后的玉米蛋白粉進行電鏡掃描，可以反映輻照處理對玉米蛋白粉表面微觀結(jié)構(gòu)的影響。 數(shù)據(jù)分析方法利用 SPSS 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果用平均數(shù)177。標準偏差（x 177。 .）表示，顯著性水平為 P。 結(jié)果與分析 單因素實驗結(jié)果以 DH 作為衡量指標，對溫度 T（℃） 、pH 值和酶比底物濃度 [E]/[S]（%）三個因素影響三種蛋白酶的酶解效果情況匯總分析，結(jié)果如圖 所示。（1）酶解溫度對 DH 的影響酶解溫度對 DH 的影響如圖 所示，在可控酶解條件下，堿性蛋白酶的酶解效果理想，DH 能夠達到 40 %以上。第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選8（a）堿性蛋白酶（b）中性蛋白酶（c）木瓜蛋白酶圖 酶解溫度對 DH 的影響Figure Effects of temperature on DH注：不同小寫字母代表差異性顯著（P）。第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選9如圖 （a）所示，溫度對其 DH 影響顯著（P） ，隨著溫度升高，DH 逐漸上升，在 60 ℃時達到最高值 177。 %，繼續(xù)升高至 65 ℃時，DH 顯著下降（P） 。中性蛋白酶的單因素實驗結(jié)果如圖 （b）所示，比較于堿性蛋白酶，其酶解物的 DH較低，當酶解溫度由 25 ℃升至 30 ℃時,DH 顯著升高（P） ，最高值達到 177。 %，隨著溫度繼續(xù)升高，DH 逐漸下降。木瓜蛋白酶的單因素結(jié)果如圖 （c）所示，同樣，相比于堿性蛋白酶，其酶解物的 DH 較低，隨著溫度升高，DH 顯著增加（P） ，在60 ℃時，DH 達到最高值 177。 %。（2）酶解 pH 值對 DH 的影響pH 值對 DH 的影響如圖 所示，堿性蛋白酶的單因素結(jié)果如圖 （a ） ，DH 隨著pH 值的升高先增加后再減少，變化顯著（P） ，pH 值為 9 時 DH 達到最高值 177。 %，符合堿性蛋白酶的應(yīng)用 pH 環(huán)境，所以選擇 pH 值為 9 進行之后的優(yōu)化實驗。中性蛋白酶的單因素結(jié)果如圖 （b）所示，隨著 pH 值的逐漸增加，DH 顯著增加（P） ，在 pH 為 7 時達到最大值 177。 %，可以選取 pH=7 進行后續(xù)實驗。木瓜蛋白酶的單因素結(jié)果如圖 （c）所示，隨著 pH 的增加，DH 顯著增加（P） ，當 pH=9 時達到最高值 177。 %。（a）堿性蛋白酶第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選10（b）中性蛋白酶（c）木瓜蛋白酶圖 pH 值對 DH 的影響Figure Effects of pH value on DH注：不同小寫字母代表差異性顯著（P） 。（3）酶比底物濃度對 DH 的影響酶比底物濃度對酶解物 DH 的影響如圖 所示，由圖 （a）可知，堿性蛋白酶酶解物隨著[E]/[S]的增加 DH 顯著增加（P） ，在[E]/[S]為 12 %時達到最大值 177。 %。中性蛋白酶的單因素實驗結(jié)果如圖 （b）所示，[E]/[S]的增加對 DH 的影響為先增加后降低。E]/[S] 為 10 %時 DH 達到最大值 177。 %。由圖 （c ）可知，木瓜蛋白酶酶解物 DH 受[E]/[S] 的影響變化顯著，當[E]/[S]升至 10 %時，DH 達到最高值 177。 %。第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選11（a）堿性蛋白酶（b）中性蛋白酶（c）木瓜蛋白酶圖 [E]/[S]對 DH 的影響Figure Effects of [E]/[S] on DH注：不同小寫字母代表差異性顯著（P）。第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選12（4）單因素實驗的最優(yōu)工藝參數(shù)根據(jù)單因素實驗結(jié)果分析，堿性蛋白酶酶解物的水解度高于其他兩種酶，因此堿性蛋白酶可以作為水解玉米蛋白的最優(yōu)蛋白酶，三種酶的單因素實驗最優(yōu)工藝參數(shù)如表 所示：表 單因素實驗優(yōu)化工藝參數(shù)T