十二烷基硫酸鈉對渦蟲再生過程中氧應激的影響研究畢業論文(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 中，使蛋白質變性后與 DNA 分開。 抗氧化物酶抗氧化系統是機體清除體內多余的活性氧、保護自身免受氧化損傷的重要體系，其中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、過氧化物酶（POD）起主要作用 [28]。 超氧化物歧化酶(SOD)超氧化物歧化酶( superoxide dismutase ，簡稱 SOD) ，是一類廣泛存在于生物體內的金屬酶，能夠催化超氧陰離子自由基發生歧化反應，平衡機體內的氧自由基，己成為化學及生物化學研究領域中熱門的研究課題。作為生物體內超氧陰離子自由基的清潔劑，SOD 在防輻射、抗老、消炎、抑制腫瘤和癌癥、自身免疫治療等方面顯示出獨特的功能，在醫學、食品、化妝品領域得到越來越多的應用。目前，世界各地學者對 SOD 的研究方興未艾，深入研究 SOD 不僅有著重大的理論意義，也有著重大的實際應用價值 [29~30]。到現在為止,人們已從細菌、原生動物、藻類、霉菌、植物、昆蟲、鳥、魚類和哺乳動物等生物體內分離得到 SOD。根據活性中心結合的金屬離子不同， SOD 主要分為：①Cu/ZnSOD，主要存在于真核細胞的細胞質中； ②FeSOD，主要存在于原核細胞和真核細胞的基質中； ③MnSOD，主要存在原核細胞及少數植物細胞中。這三類 SOD 都催化超氧化物自由基 O2發生歧化反應： O2+ O2 +2H+→H 2O2+O2而作為研究工作的基礎，SOD 活性的測定方法也得到不斷的改進， SOD 的活性測定方法一般分直接測定法和間接測定法。直接測定法的原理是直接測定 SOD 催化反應的底物反應速度或產物生成速度。常見的直接測定方法有EPR 法、脈沖輻解法、超氧化鉀法等。直接法需專用的儀器,故此類方法一般實驗室較難應用。間接測定法是通過某種能產生 O2的系統，使 O2進行另一個便于檢測的反應，測定特征波長下的光吸收變化速率，計算 SOD 對這個反應的抑制程度從而間接定量 SOD 活性。常見的間接測定方法有黃嘌呤氧化酶細胞色素 C 法、鄰苯三酚自氧化法、微量鄰苯三酚自氧化法、黃嘌呤氧化酶NBT 法、NBT 光還原法等。本試驗采用微量鄰苯三酚自氧化法 [31~35]。 過氧化氫酶(CAT)過氧化氫酶( Catalase, CAT, EC 1. 11. 1. 16)是一種含鐵葉琳的酶 [36]，其活性中心是血紅素，能將過氧化氫催化分解成氧和水。各種來源的 CAT 都是由四個亞基組成，Fe (III)—原葉琳將這四個亞基連接成一條具有酶活性的多膚鏈。CAT 廣泛存在于動物、植物和微生物中，動物肝臟、紅細胞、植物葉綠體以及細菌、真菌、放線菌等中含有大量 CAT。在哺乳動物以肝和腎臟 CAT 活性最高，結締組織活性最弱。人體紅細胞中 CAT 活性是血清中的 3600 倍。它的主要生理作用就是催化過氧化氫分解為水和氧氣，使得過氧化氫不致于與 在鐵螯合物作用下反應生成非常有害的 .OH。多酶促反應和非酶促反應都能產生H2O2，H 2O2是有毒害作用的活性氧的前體。CAT 可非常有效地催化 H2O2的分解，使其失去活性氧的作用，保護機體。因此，過氧化氫酶對于減輕活性氧損傷具有一定的意義。過氧化氫酶對過氧化氫的分解如下：反應式：2H 2O2 →2H 2O +O2↑在此反應中，過氧化氫可同等程度的釋放和吸收電子，即它在反應中即可作氧化劑，又可作還原劑。它是清除過氧化氫的重要酶，因此，日益受到注意和重視。CAT 活性測定的方法很多，大致可分為 3 類：(1)底物(H 2O2)消耗，如滴定法（碘滴定法。高錳酸鉀滴定法）、紫外吸收法、紫外速率法、比色法及 H2O2電極法等，有人用鋁酸錢比色法測定血清、細菌過氧化氫酶活性。(2)生成物(O2)的產生，如氧電極法、極譜法，測壓法等，有人用微量呼吸檢壓儀和呼吸計來檢測蜂花粉中過氧化物酶活性的。(3)免疫測定法以及電泳測定法等。在諸多的測定方法中，以紫外吸收法最為簡便，但樣品中應無在 240nm 處有強吸收峰的物質；而極譜法等因受實驗設備儀器條件的限制 [37~38]。本實驗采用了第一類中改進的貝爾斯—西策爾斯（Beers – Sizers ）法。 過氧化物酶（POD）過 氧 化 物 酶 是 由 微 生 物 或 植 物 所 產 生 的 一 類 氧 化 還 原 酶 ， 它 們 能 催 化很 多 反 應 。 雖 在 動 物 體 內 含 量 很 少 ， 但 也 發 揮 著 重 要 作 用 。 過氧化物酶存在于牛奶、淚液、唾液中，能抑制某些細菌生長和產酸，在過氧化氫存在的條件下，能催化硫氰酸鹽離子(SCN ) 發生氧化反應，中間產物均是強氧化劑，進入菌體后，阻斷已糖激酶、6 磷酸葡萄糖脫氫酶等代謝通路，從而抑制細菌增。在 細 胞 內 主 要 存 在 于 的 過 氧 化 物 酶 體 中 ,以 鐵 卟 啉 為 輔 基 ,可 催 化 過 氧 化氫 氧 化 酚 類 和 胺 類 化 合 物 ,具 有 消 除 過 氧 化 氫 和 酚 類 、 胺 類 毒 性 的 雙 重 作 用 。目 前 對 POD的 研 究 主 要 在 植 物 方 面 ， 尚 未 有 動 物 再 生 方 面 的 研 究 。 課題涉及的主要內容（1）對渦蟲進行 SDS 脅迫處理，再生培養，獲得實驗材料。（2）對獲得材料進行 SOD、CAT 的提取。（3）酶活測定條件的探索。（4）SDS 脅迫濃度的探索。（5）SOD,CAT 酶活性的測定。（6）SDS 對再生過程中抗氧化系統影響的綜合分析。 第二章 實驗方法 實驗材料、試劑及儀器 實驗材料實驗用淡水渦蟲取自淄博市淄川區源泉鎮泉河頭小溪，運回實驗室后，在室溫下喂養在培養皿中（遮光） 。實驗前饑餓一周。 主要試劑及藥品藥品名稱 規格 生產廠家十二烷基硫酸鈉 GR Japan鹽酸 AR 煙臺市雙雙化工有限公司磷酸二氫鉀 AR 上海金山化工試劑有限公司無水乙醇 AR 萊陽市經濟技術開發區精細化工廠氫氧化鈉 AR 萊陽市經濟技術開發區精細化工考馬斯亮藍 G250 AR 美國 SanlandEDTA Na2 BC 北京索萊寶磷酸 AR 萊陽市雙雙化工有限公司三 羥 甲 基 氨 基 甲 烷 （ Tris） AR 北京拜爾迪生物公司焦性沒食子酸 AR 國藥集團化學試劑有限公司過氧化氫（30%） AR 萊陽市康德化工有限公司磷酸二氫鈉 AR 天津市大茂化學試劑廠牛血清蛋白 AR 上海匯申化工有限公司氫氧化鈉 AR 萊陽市經濟技術開發區精細化工廠 主要實驗儀器及設備儀器名稱 規格/型號 生產廠家紫外分光光度計 UV3310 HITACHI 公司高速冷凍離心機 Avanti J25 美國 BECKMAN 公司PH 計 PH213 上海一恒科學儀器有限公司電熱恒溫水浴鍋 HWS24 上海一恒科學儀器有限公司臺式高速冷凍離心機 D37520 德國 Kendro 公司分析天平 AR2140 美國 Ohaus 公司電子天平 BS110 北京賽多利斯電子天平有限公司 試劑的配制(1)100mmol/l 過氧化氫溶液：取 30％過氧化氫 用磷酸緩沖液定溶到25ml，可置于冰箱中保存 1 天，最好現配先用。(2)50mmol/L， 的 TrisHCl ：稱取 Tris ，EDTA2Na ，用雙蒸水溶解至 80mL 左右，用 HCl 調節 pH = 用 pH 計校正，最后定容至100mL。放入冰箱 4℃保存，此溶液可保存較長時間。 (3)50 mmol/L 鄰苯三酚 ：稱取鄰苯三酚 ，用 10mmol/L HCl 溶液溶解，定容至 10mL，避光保存，最好現配先用。 (4)標準蛋白質溶液：牛血清血蛋白溶液（BSA）：準確稱取牛血清蛋白10mg，溶于蒸餾水并定容到 100ml，配制成 100μg/ml 原液。 (5)考馬斯亮藍試劑：考馬斯亮藍 G250 100mg 溶于 50ml 95%乙醇，加入100ml 85%濃 H3PO4100ml，最后用蒸餾水稀釋至 1000ml。此溶液常溫下可放置一個月。(6)各濃度 SDS 溶液：取 30mgSDS 在 500ml 容量瓶中定容，配成 60mg/l的母液，需要時稀釋成其它濃度。(7) 的磷酸緩沖液： 磷酸二氫鉀+ 氫氧化鈉，加雙蒸水稀釋，定容至 100ml。(8)TrisHCl ，TrisHCl ：48ml 的 M HCl + Tris，加雙蒸水80ml，調節 pH 到 定容到 100ml。(9) 總蛋白提取液:,7mgEDTANa,15mgDTT,20ml 的甘油，80ml 水，用 NaOH 調節 PH 到 。 實驗材料的獲取 渦蟲采集方法采集方法：采集中，將采集瓶中灌滿當地溪水，將水中光滑的石塊迅速拿出水面，立即將石塊底面翻到面前，仔細地觀察和尋找，當發現目標時，立即用毛筆輕輕而敏捷地將蟲一個個刷入采集大廣口瓶中。當刷過幾條渦蟲后，毛筆的筆尖被渦蟲分泌的粘液粘在一起，這時要將筆尖放入水中，用手指搓洗干凈后再繼續使用。當天氣炎熱時采集渦蟲，除在瓶中放入巖壁上收集的水草，另在水中取一洗凈的石塊也同時放入瓶中，這樣可減輕溫度驟升和陽光的直射，防止渦蟲死亡 [39]。由于渦蟲在溫度過高時身體會發生分解，所以采集到大量渦蟲后要加入冰袋，防止回來途中因溫度高分解死亡。 渦蟲培養方法用涼白開水(除氯)，使用前提前一夜進行充氧。一般每天換水 1次，在培養器皿中放入洗凈的瓦片，每周喂食 1次，取當天煮熟蛋黃少許，放入小燒杯中加水吹打成漿狀，每次喂一吸管。喂食時，先將一葉苔拔至燒杯一側，吸管吸蛋黃液，將吸管輕輕伸至杯底，用手指慢慢擠滿管頭，滴管在杯底一小范圍內來回移動，使蛋黃液均勻鋪在杯底，以防止四處擴散。然后將滴管提起，離開水面。喂食時每天換水兩次，保證渦蟲正常生長。 渦蟲再生脅迫培養再生培養前，對渦蟲饑餓處理一周。(1) 渦蟲的切割方式：渦蟲在切割前停止喂食 7d。切割時用毛筆挑起渦蟲,將它放在載玻片上,靜置片刻，待渦蟲身體伸直，用雙面刀片，迅速切下頭部，此時蟲體仍在蠕動，取后端進行培養。(2)SDS 濃度的選取：通過半致死濃度及預實驗確定，結果表明半致死濃度為 。所以取 SDS 濃度為： 、1mg/l、2mg/l、3mg/l 對渦蟲進行再生培養。(3) 渦蟲的脅迫培養: 選取 SDS 的 6 個濃度：、1mg/l、2mg/l、3mg/l，另一組為空白對照：加煮沸并充氧除去氯氣的水。每個濃度梯度做三個平行實驗，每個實驗處理培養 10條已切渦蟲，每 24h 更換一次培養液。渦蟲再生 1d、4d、7d, 10d，再生培養期間不必喂食。(4)渦蟲的對照培養：、1mg/l、2mg/l、3mg/l ，另一組為空白對照：加煮沸并充氧除去氯氣的水。每個濃度梯度做三個平行實驗，每個實驗處理培養 10 條未切渦蟲，每 24h 更換一次培養液，處理兩天。(4)完整渦蟲處理 2d , 渦蟲再生 1d、4d、7d, 10d，分組測定 SOD,CAT 酶活。 渦蟲上清液的提取渦蟲取出后用去離子水洗滌三遍，再用 ，放入液氮中冷凍，取出后放在預冷研缽中，加入液氮研磨，加入 總蛋白提取液，充分混勻，再用 12022r/min離心機 4℃離心 10min，取上清液，分裝后于70℃下冰箱保存備用。 蛋白標準曲線制作及樣液測定 實驗原理在研究每一種酶的作用時，常用蛋白標定結果。因此測定生物體內可溶性蛋白含量是研究酶活的一個重要項目。常用測定方法有 Lowry 法和考馬斯亮藍G250 染料結合法。本實驗采用后者。考馬斯亮藍 G250 再游離狀態下呈紅色，當它與蛋白質疏水區結合后變為青色，前者最大光吸收在 465nm，后者在 595nm。在一定蛋白質濃度范圍內（0100μg/mL）,蛋白質— 色素結合物在 595nm 波長下的光吸收與蛋白質含量成正比。故可用于蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍 G250 結合在 2