生物工程畢業(yè)設計論文-毒死蜱降解微生物的篩選及其生長條件的研究(編輯修改稿)

　

【文章內(nèi)容簡介】 土壤和水體中化學農(nóng)藥的去毒與凈化是治理化學農(nóng)藥污染的有效方法 [8]，并已顯示出良好的應用前景。 有機磷農(nóng)藥的微生物降解途徑 有機磷農(nóng)藥被微生物降解是它們在土壤中轉(zhuǎn)化的重要途徑，有機磷農(nóng)藥的微生物降解主要存在以下過程 ： 一種是微生物本身含有可降解該農(nóng)藥的酶系基因，當有機磷農(nóng)藥進人土壤后，微生物馬上能產(chǎn)生降解有機磷農(nóng)藥的降解酶，在這種情況下，降解菌的選育較為容易 ； 另一種是微生物本身并無可降解該有機磷農(nóng)藥的酶系 ，當農(nóng)藥進人環(huán)境以后，由于微生物生存的需要，微生物的基因發(fā)生重組或改變，產(chǎn)生新的降解酶系。 YonezawwaY(1979)[8]等認為當微生物對有機化合物的降解作用是由其細胞內(nèi)的酶引起時，微生物降解的整個過程可以分為三個步驟 ： 首先是化合物在微生 7 物細胞膜表面的吸附，這是一個動態(tài)平衡 ； 其次是吸附在細胞膜表面的化合物進入細胞膜內(nèi)，在生物量一定時，化合物對細胞膜的穿透率決定了化合物穿透細胞膜的量 ； 最后是化合物進入微生物細胞膜內(nèi)與降解酶結合發(fā)生酶促反應，這是一個快速的過程。有機磷農(nóng)藥通常含有 P=S 鍵和 P=O 鍵，有些 有機磷農(nóng)藥 (如甲胺磷 )還含有 PN 鍵。當有機磷農(nóng)藥進人土壤環(huán)境，土壤中的微生物產(chǎn)生相應的酶，在這些酶的作用下，上述化學鍵被打斷，使有機磷農(nóng)藥被降解。 Mageong(1994)[8]等報道大腸桿菌產(chǎn)生的磷酸三酯酶能打開甲胺磷的 PS鍵。Bello Ramirez A M(2020) [9]等也證實氯代過氧化物酶可以切斷有機磷農(nóng)藥中的PS 鍵。阮少江等 (2020) [10]推測甲胺磷的微生物降解是甲胺脫氫酶打斷 PN 鍵開始的。有機磷農(nóng)藥對土壤中的活性酶也存在抑制性，抑制程度的大小隨著外界環(huán)境的變化而變化，而且 不同種類的有機磷農(nóng)藥對酶的影響也是不同的，但反過來，有機磷農(nóng)藥對酶的活性也具有一定的刺激作用，朱南文等 (1996) [11]發(fā)現(xiàn)在施用甲胺磷 14d 內(nèi)，甲胺磷對土壤中酸性磷酸酶、中性磷酸酶和堿性磷酸酶呈一定的抑制作用，而在 4d 以后，對酶的抑制性消失，甚至出現(xiàn)了刺激效應。郭明等 (2020) [12]發(fā)現(xiàn)在 7d 以內(nèi)，氧化樂果和久效磷對土壤中的脫氫酶產(chǎn)生抑制作用，在 9d以后，對脫氫酶的抑制作用消失，反而有一定的激活作用。這可能是因為當有機磷農(nóng)藥開始加人土壤后，農(nóng)藥的濃度高對土壤中微生物生長和活動產(chǎn)生抑制作用，從而 對微生物體內(nèi)酶和土壤中的游離酶產(chǎn)生抑制作用，但有機磷農(nóng)藥能促進土壤中一些微生物 (如細菌、真菌和放線菌等 )的生長并抑制一些微生物 (如固氮菌 )的生長，所以隨著細菌、真菌和放線菌數(shù)量的增多以及農(nóng)藥濃度的減少，酶的活性也就提高了。 有機磷農(nóng)藥在土壤中的微生物降解還受到農(nóng)藥濃度的影響，當農(nóng)藥濃度過高，對微生物的毒性越大，可使微生物的數(shù)量顯著下降。而當農(nóng)藥濃度過低時，由于微生物生長的碳、氮源不足，抑制了微生物的生長，從而抑制有機磷農(nóng)藥的微生物降解，實驗證實樂果濃度在 %時微生物降解的效果最好，而在 %和%則呈下降趨勢。王永杰等 (1999) [13]也推斷在自然環(huán)境中，有機化合物的濃度極低可能是限制其生物降解的一個主要因素。一種有機磷農(nóng)藥可被多種微生物降解；同時，一種微生物也可對多種有機磷農(nóng)藥進行降解。因此，土壤中的微生物數(shù)量和種類對于有機磷農(nóng)藥的降解有著重要的作用。 8 有機磷農(nóng)藥微生物降解的研究進展 自上世紀 70 年代開始，人們就發(fā)現(xiàn)有些土壤微生物對有機磷農(nóng)藥具有降解作用。到目前為止已發(fā)現(xiàn)的有機磷降解微生物包括細菌、真菌、放線菌和藻類。進一步研究發(fā)現(xiàn)這些微生物之所以能降解有機磷農(nóng)藥是因為它們能分泌一 種能水解磷酸酯鍵的酶，即后來研究的有機磷農(nóng)藥降解酶。 20 世紀 80 年代， Munnecke等 (1980)發(fā)現(xiàn)有機磷農(nóng)藥降解酶比產(chǎn)生這類酶本身，特別是對低濃度的農(nóng)藥。因此，人們的思路從應用微生物菌體凈化農(nóng)藥污染轉(zhuǎn)向利用有機磷農(nóng)藥降解酶。隨著分子生物學的發(fā)展，對有機磷農(nóng)藥降解酶的研究目前已進入到分子水平，數(shù)種微生物來源的有機磷農(nóng)藥降解酶已得到分離純化并進行了較深入的生理生化研究。其中兩株對硫磷降解菌 Flavobacterium (Walter ,1980)和 Pesudomonas diminuta GM( McDaniel,1988)的降解酶得到了深入細致的研究，分離得到了降解酶基因（ opd），比較發(fā)現(xiàn)兩者基因具有很強的同源性，并且這兩株菌的降解酶基因都定位于細菌內(nèi)的大質(zhì)粒上。由于這兩種酶本身就是同源性很高的酶，所以二者在空間結構上極其相似。 通過底物類似物親和晶體的 x－衍射的方法，國外的學者們研究了酶的三維構象，發(fā)現(xiàn)酶是同源二聚體，其催化中心具有 2 個 Zn2+離子，它們?yōu)槊傅膸讉€重要的氨基酸殘基（ His55,His57,Lys169,Asp301,His201,His230）所圍繞，形成雙核金屬催化中心，在這里金屬離子結合的羥離子可以親核攻擊底物的親核性磷原子，促進水解反應的發(fā)生，從而使農(nóng)藥毒性降低。 最近又有報道， 的 opd 基因兩側(cè)基因簇有轉(zhuǎn)座子特性。 Munnecke 等分離到的有機磷農(nóng)藥降解酶對試驗用的甲基對硫磷、對硫磷、二嗪農(nóng)、毒死蜱等 7 種有機磷農(nóng)藥均能有效降解，在 22℃ 時降解效率比化學降解快 10002450 倍，且該酶不為農(nóng)藥及農(nóng)藥制劑中溶劑所抑制，對環(huán)境條件有較寬的忍受范圍。 1991 年， Defrank 等從一 株嗜鹽細菌中純化得到一種有機磷農(nóng)藥降解酶，分子量 60KD，可被 Mg2+和 Co2+激活，對含磷氟鍵的有機磷化合物作用較好，對含磷氧鍵的有機磷化合物作用不好。與 OPH 相比， OPDA 降解二甲基底物的速度更快，但對于二乙基底物的水解速度無關。 2020 年， 等 ( ,2020)從澳大利亞分離到一株降解乙硫磷的微生物，分 9 離提純了降解酶，并對它的酶動力學進行了初步研究。這些研究使得關于有機磷農(nóng)藥降解酶的認識得到進一步深入，酶學機理得到進一步了解。 我國關于有機磷農(nóng)藥降 解酶的研究起步較晚，但近年也已取得了較大進步。李順鵬等 (2020) [13]分離了多株有機磷降解菌，并對其進行了詳細研究，分離獲得了多種有機磷農(nóng)藥降解酶的基因，實現(xiàn)了融和表達，并對酶學性質(zhì)進行了分析。從菌株 M6 中分離提純的有機磷農(nóng)藥降解酶經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，其 C－末端含有 6 個寡聚組氨酸，水解甲基對硫磷時，最適 ，最佳反應溫度 15℃ ； Mn2+、 Zn2+、Cu2+可使酶活性增加 15％－ 20％， Ca2+、 Mg2+微弱的促進酶的作用， Ni2+對酶活性幾乎無影響； 1mmol/+ 幾乎不影響酶的 活性，而 10mmol/L +對甲基對硫磷水解酶有較強的抑制作用。陳亞麗 (2020)[14]等從一株假單胞桿菌 WBC3 中分離到降解甲基對硫磷的有機磷農(nóng)藥降解酶，已進行 X－衍射分析其三維結構。從曲霉菌中分離純化出有機磷降解酶，此酶對有機磷農(nóng)藥樂果具有很好的降解作用，它的最適反應溫度 45℃ ，最適反應 ，對熱穩(wěn)定，并能在 pH610 范圍保持活性，重金屬、 Cu2+對該酶有明顯的促進作用，而 SDS對其具有抑制作用，這是首例來自真菌的磷酸三酯酶。 應用有機磷農(nóng)藥降解酶就必須解決一個關鍵性的問題 ——如何工業(yè)化、廉價、快速生產(chǎn)有機磷農(nóng)藥降解酶。有機磷農(nóng)藥降解酶在原始天然菌株中含量太低，難以進行大量生產(chǎn)，生產(chǎn)成本昂貴。這是目前世界上還未有商品化生產(chǎn)的有機磷農(nóng)藥降解酶產(chǎn)品以及在生產(chǎn)實踐上推廣應用的關鍵原因。近年來，隨著分子生物學及基因工程的發(fā)展，有機磷降解酶的基因工程的研究也取得了一定發(fā)展，為其大規(guī)模廉價生產(chǎn)奠定了基礎。 降解有機磷農(nóng)藥的微生物種類 綜述有關文獻發(fā)現(xiàn) [18,19]： (1)能夠降解農(nóng)藥的有 細菌，真菌，放線菌藻類，其中，細菌本身在生理生化具有多種適應能力以及容易誘發(fā)突變，因此，這使得細菌在降解農(nóng)藥中占主導地位。 (2)同樣的菌株能夠降解不同的農(nóng)藥，一種農(nóng)藥同時可以被不同菌株降解。表 [20]為部分菌種和其能夠降解的農(nóng)藥。 10 表 部分菌種和其能夠降解的農(nóng)藥 Table Some parts of pesticides degraded strains and species of pesticides 微生物的種類 有機磷農(nóng)藥種類 細菌 芽孢桿菌屬 (Bacillus) 甲胺磷、苯硫磷、氧樂果、對硫磷、敵敵畏、甲基對硫磷、 節(jié)細菌屬 (Arthrobacter) 馬拉硫磷、二嗪農(nóng) 假單胞菌屬 (Pseudomonas) 馬拉硫磷、甲拌磷、甲胺磷、敵敵畏、樂果、對硫磷、甲基對硫磷 黃單胞桿菌屬 (Canthomonus) 對硫磷、殺螟松、殺螟睛 黃桿菌屬 (Flavobacterium) 對硫磷、甲基對硫磷、馬拉硫磷、毒死媲 短桿菌屬 (Brevibacterium) 對硫磷、甲基對硫磷 硫桿 菌屬 (Ihiobacillus) 甲拌磷 極瘤細菌屬 (Rhizobium) 馬拉硫磷、對硫磷 固氮極毛桿菌屬 (Azotomonus ) 對硫磷、毒死媲 不動桿菌屬 (Aciobacterium ) 甲胺磷 動性球菌屬 (Planococcus) 水胺硫磷 真菌 木霉屬 (Trichoderma) 敵敵畏、對硫磷、馬拉硫磷 根霉屬 (Rhizopus) 地蟲磷、溴硫磷 曲霉屬 (Aspergillus) 敵百蟲、溴硫磷、地蟲磷、樂果、甲胺磷 青霉屬 (Pinicielium) 地 蟲磷、敵百蟲、對硫磷 酵母屬 (Saccharomyccs) 敵敵畏、對硫磷、馬拉硫磷 鐮刀菌屬 (Fusarium) 敵百蟲 藻類 小球綠藻屬 (Chlorolla) 甲拌磷、對硫磷 放線菌 鏈霉屬 (Streptomyces) 二嗪農(nóng) 11 第二章 有機磷農(nóng)藥降解 菌 的篩選及生長條件的研究 試驗材料 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基： (1)細菌： 牛肉膏 3 g，蛋白胨 10g， NaCl5g，瓊脂 1520g，蒸餾水l000ml， pH 值 ～ 。 (2)真菌：馬鈴薯 200g，葡萄糖 20g，瓊脂 1520g，蒸餾水 l000 ml，自然 pH[21]。 無機鹽培養(yǎng)基 : K2HPO4 0. 2g， KH2PO4 0. 8g ， MgSO47H2O 0. 2g ， CaSO42H2O 0. 1g ， Na2MoO42H2O ， FeSO47H2O 0. 005g ， (NH4)2SO4 1. 0g ， 蒸餾水 1000mL,調(diào)節(jié) 。 選擇培養(yǎng)基 (瓊脂平板 )：在富集培養(yǎng)基的基礎上加入 100mg/L的毒死蜱。 樣品及試劑 土壤：土樣取自藍天實業(yè)辛硫磷車間附近。 試劑如表 主要儀器 及設備 主要儀器及設備如表 試驗方法 菌種的分離及篩選 采用固體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)法，稱取土樣 1 g于 5mL無菌水中振蕩混勻制成菌液。將上述菌液分別均勻地涂布在細菌和真菌固體富集培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中毒死蜱的濃度為 60mg/L，置于 30℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 2天后，挑取有明顯透明圈的菌落劃線轉(zhuǎn)移至農(nóng)藥濃度提高的新鮮富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 2天，連續(xù) 5次轉(zhuǎn)接直至富集培養(yǎng)基中農(nóng)藥濃度提高到 480mg/L。最后，接種斜面，編號保存。 12 表 試劑 Table The reagents 試劑名稱 生產(chǎn)廠家 牛肉膏、蛋白胨 梁山科泰生物制品有限公司 葡萄糖、蔗糖 廣東汕頭市西隴化工廠 瓊脂條 福建省石獅市瓊脂副食品加工廠 對二甲氨基苯甲醛、 FeSO 對硝基苯酚 天津市博迪化工有限公司 KH2PO4 、 Na2MoO4， CaSO42H2O 西安化學試劑廠 MgSO47H2O、 (NH4)2SO4 、 K2HPO4 西安化學試劑廠 NaCl、 NaOH、 HCl、 95%乙醇 西安化學試劑廠 無水乙醇、甲醇、丙酮 西安化學試劑廠 毒死蜱 美國陶氏益農(nóng)公司 30%H2O2 天津市化 學試劑六廠 溴百里香酚藍 上海慨洋生物技術有限公司 尿素、檸檬酸鈉 天津市瑞金特化學品有限公司 明膠 青島化學試劑廠 甲基紅 天津市東方衛(wèi)生材料廠 乙醚、硫代硫酸鈉 西安化學試劑廠 半乳糖 上海試劑二廠 表 儀器及設備 Table Instruments and equipment 儀器名稱 及型號 生產(chǎn)廠家 SWCJ1G型單人凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司 LRH250Ⅱ 生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠 LDZX75KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠 HZQF全溫振蕩培養(yǎng) 哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司 實驗室 pH計 梅特勒 托利多儀器（上海）有限公司 722光柵分光光度計 上海精密科學儀器有限公司 XSZ2GA光學顯微鏡 重慶光電儀器有限公司 13 菌種的鑒定 2． 2． 2． 1 形態(tài)特征 （