培養方法對土壤可培養細菌多樣性的影響及兩株新菌的初步鑒定畢業論文(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 物群落多樣性。從土壤中簡單提取和平板培養計數不能得到土壤微生物在土壤生態系統中的生活特征和生態功能的信息[22]。純培養方法和原理大多數是從研究有關醫用微生物的方法中引用過來的，其實有些方法對土壤微生物研究并不適合。例如在自然土壤生態環境下，許多土壤微生物處于貧營養狀態，而在實驗室通常用營養豐富的牛肉汁蛋白胨來測定土壤活細菌的總數，因而大量的貧營養微生物不能生長，其測定結果誤差大；實驗室在分離培養土壤細菌時，通常只是在28℃下培養，雖然土壤中存在高溫型細菌，但土壤中的低溫型細菌卻被忽視了。由于傳統的平板培養方法只能反應極少數微生物的信息，這些結果不但不能充分反映土壤微生物生態功能，而且還埋沒了大量極有應用價值的微生物資源。所以傳統的研究方法只能作為一種輔助手段，只有與其他先進方法結合起來時才能較為客觀和全面的反映微生物群落結構的真實信息。但這種方法適合分離具有特定功能的特殊目標物種，利用該方法已獲得許多應用價值的微生物種類，并應用于基因介導及生態恢復等方面。 BIOLOG鑒定系統BIOLOG系統自從Garland和Miss于1991年建立起來后，廣泛應用于評價土壤微生物群落的功能多樣性:不同土壤類型[23 ]、不同植物物種下的土壤[24 ]、不同管理策略下的農業土壤[25, 26 ]和不同植被的根際土壤[27]。此方法是根據微生物對單一碳源底物的利用能力差異，當接種菌懸液時，其中一些孔中的營養物質被利用，使孔中的氧化反應指示劑四氯唑紫呈現不同程度的紫色，從而構成該微生物的特定指紋。經過BIOLOG系統配套軟件分析，并與標準菌種的數據庫比較之后，該菌株的分類地位便被確認出來。Biolog 法被用于多種病原微生物的鑒定和環境微生物群落的研究中。通過 Biolog 法進行環境微生物研究時無需分離培養純種微生物，就可獲得有關微生物群落總體活性與代謝功能的信息，最大限度地保留了微生物群落原來的代謝特征，且靈敏度高，分辨力強，數據的讀取與記錄都可由計算機輔助完成。但BIOLOG只能反映少數適合在微平板(microplate)培養基上生長的微生物，即通過微生物群落對選擇性培養基或刺激物的反應來測定代謝活性，所以不能反映實際狀態[28]。另外由于培養環境的改變可能引起微生物對碳底物實際利用能力的改變而造成一定的誤差，并且由于目前所擁有的標準數據庫還不完善，所以有些種類還不能被準確鑒定。即使存在以上缺點，但由于可以快速、簡便地獲得大量土壤微生物群落結構和功能多樣性方面的信息，仍被認為是一種較好的方法。 磷脂脂肪酸（PLFA）分析磷酸脂肪酸是微生物結構的穩定組成成分，分析脂肪酸的種類及組成比例可鑒別土壤微生物的多樣性。磷脂脂肪酸圖譜分析法的基本流程是:首先將磷脂脂肪酸全部提取出來，然后用氣相色譜或氣質聯用進行分析，得出PLFA圖譜[29]。群落的微生物結構發生變化，就可通過圖譜的變化得到快速有效的監測。使用磷脂類化合物中的脂肪酸組成估價土壤微生物的群落結構是近幾十年常用的一種生化方法。磷脂類化合物只存在于所有活細胞膜中，一旦生物細胞死亡， 細胞膜很快就被降解，磷脂脂肪酸會被迅速的代謝掉，生物中的磷脂類化合物能顯示出一快速轉換率，而且生物可以含有相對固定量以磷脂類化合物形式作為它們的生物量[30]。一些學者曾發現使用直接從土壤中提取的磷脂類化合物的量可準確地表達為土壤的微生物量[31]。磷脂類化合物的這些特征和磷脂類化合物與生物關系的密切性，決定了可用其作為土壤中微生物標志化合物的可能性，此外，脂肪酸具有屬的特異性，特殊的甲基脂肪酸已經被作為微生物分類的依據。因此，許多研究者用包括土壤在內的環境樣中可提取磷脂類化合物中的脂肪酸(PLFA)組成來直接估價其微生物的群落結構[30, 31]。PLFA方法雖然能跟蹤研究微生物群落的動態變化，能快速有效的從環境樣品種提取大部分脂肪酸，但是也有其局限性。第一，他不能從種的水品上鑒定微生物，只能鑒定到屬；第二，這種方法依賴于標記脂肪酸，標記脂肪酸變化導致錯誤的群落變化估計，因此操作過程需要十分小心謹慎，防止人為因素的干擾。第三，細菌和真菌在不同的生長時期以及環境壓力下的脂肪酸含量有所變化，給監測帶來困難[32]。分子生物學研究方法 基于分子雜交技術的分子標記法熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技術 環境樣品直接作原位雜交(in situ hybridization)，可以得到未知菌的微生物多樣性的大量信息，如微生物的形態特征和豐度及在樣品上的空間分布和動態，原位雜交技術能有效對環境微生物的樣品進行定量。如 Jain 等采用特異性的探針對地下水中的細窺進行了原位雜交，研究了細菌有關質粒基因的存在和分布情況。熒光原位雜交技術就像Northern、Southern印記一樣，是基于兩個寡核苷酸通過互補序列配對。但FISH的靶序列是留在組織中而沒有必要要像Northern、Southern技術一樣在雜交之前首先要分離核酸[33]。該方法中，整個細胞是被固定的。首先它的16S或者23SrRNA與熒光標記的特異性寡核苷酸探針進行雜交；再由掃描共焦激光顯微鏡(Scanning confocal laser microscopy，SCLM)觀察固定的細胞。由于雜交的是細胞，所以不需要提取DNA，進行PCR擴增以及克隆等步驟。Gall和Pardue最早描述了熒光原位雜交技術[34]。這項技術最早應用是放射性的互補序列作探針對DNA靶序列進行研究。后來Manning等人首次將非放射性的原位雜交技術應用于細胞遺傳學的研究[35]。FISH技術的應用受到環境樣品微生物生理狀態的影響，芽孢、放線菌及休眠時期的細胞的細胞膜的通透性低，會影響群落中部分種屬豐度的錯誤估計。而且，FISH由于事先要根據已知種屬設計探針，不能檢測出環境樣品中的未知種屬[36]；但它能將單個細菌從復雜的菌群背景中檢測出來，并加以定量，所需時間很短，有望成為一種常規的簡便分析方法。 基于PCR技術的DNA指紋圖譜技術PCR技術是1985年由Mullis發明的一種聚合酶鏈式反應技術，主要特點是短時間內能在實驗室條件下人為地控制并特異擴增目的基因或DNA片段，使研究的目的基因及樣品中的微量微生物基因得到擴增，為分子微生物生態學的研究提供了非常方便的手段。1990年，Ward[4]等人利用對環境微生物的16SrRNA序列分析，揭示了環境中存在大量未培養微生物。因此，大量基于16SrRNAPCR的分子微生物學方法被發展應用于復雜的微生物生態研究，為微生物群落多樣性提供了圖案或輪廓，分析時有直觀、快速、高通量的特點。 限制性片段長度多態性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP) / 擴增核糖體 DNA 限制性分析(Amplified ribosomal DNA restriction analysis， ARDRA) 限制性片段長度多態性( RFLP) 又叫擴增核糖體 DNA 限制性分析(ARDRA)， 是一種基于 PCR 的分析環境微生物多樣性的方法。該技術是Bostein首先提出的一種分子遺傳標記，是第一代以DNA指紋圖譜為基礎用于微生物分型鑒定的方法。其原理是根據不同生物個體或種群之間DNA片段酶切位點有所差異的特點，利用限制性內切酶進行消化，產生長短、種類、數目不同的限制性片段，然后對這些特定DNA片段的限制性內切酶產物進行分析，根據特定的限制性酶譜圖可對群落中的微生物加以區分。其主要特點是:(1)可以直接研究微生物種群的目標 DNA 組成，而且由于限制性內切酶識別序列具有專一性，所以用 RFLP 技術進行多態性分析具有較高的可靠性；(2)運用該技術時所涉及的遺傳信息較多，區分種群差異的能力更強，因此該方法對微生物群落多樣性，尤其是微生物的分類和鑒定具有重要意義[37, 38] 。該方法最大的缺點就是酶切后形成的條帶太多，不宜分析，減少限制性內切酶的數量或選用酶切位點為6bp的限制性內切酶可減少限制性片斷的數量，能提高其分辨率。另外，同一類群的微生物酶切后會產生幾個片斷而降低檢測靈敏性。 但是該方法工作量特別大，目前還無人對這些工作進行重復。 隨機擴增多態性DNA技術(random ampliflyied pomorphic DNA, RAPD) 隨機引物擴增多態性方法是以人工隨機合成的DNA分子為引物，以基因組DNA為模板，通過PCR技術對多態性DNA片段隨機合成。若某一引物分子與某一片段DNA模板具有互補的核酸序列，該引物分子就會結合到單鏈的DNA模板上，合成一段新的互補DNA鏈。對整個基因組的DNA分子而言，某一引物可能會與單鏈DNA的許多位點結合。然后對擴增產物進行電泳，用EB染色，就可以直接檢驗出被擴增的DNA多態性。該方法適用于微生物種間、亞種間乃至菌株間的親緣關系分析，以及未知菌株的快速鑒定等[39]。在同一地點重復進行這種群落篩選的方法，就可以確定在一個特定位點或一個特定生態系統中微生物生物多樣性的變化情況[40]。與RFLP法相比，RAPD法所需的模板量少，操作快，不需要知道DNA序列信息，并且能迅速獲得基因圖譜，標記密度較大；而且DNA樣品需要量較少，引物價格便宜，成本較低。但是RAPD法實驗重復性較差，結果可靠性較低，一般可以通過對單鏈引物進行篩選，優化PCR條件來克服這一弊端。 擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism，AFLP) AFLP是PCR和RFLP技術發展的一種新型DNA指紋技術。該技術利用了RFLP的可靠性和PCR的高效性，對基因組DNA酶切片段進行選擇性擴增，其實就是利用2種以上的酶切割DNA形成不同酶切位點的限制酶切片段，在所得的酶切片段上加上雙鏈人工接頭，作為PCR擴增的模板。AFLP對PCR的引物作了修飾，將引物與酶切片段識別序列結合起來，核心序列與人工接頭互補，從而實現選擇性擴增。擴增產物經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，顯示擴增片段長度多態性[41]。AFLP 集 RFLP 和RAPD 的優勢為一體，既具有高的分辨力，準確性和重復性，又克服了RFLP的繁瑣操作，成為遺傳多樣性檢測和系統分類及基因定位的主要分子標記技術。不足之處是得到的主要是顯性，而非共顯性標記；且AFLP引物需要用同位素標記，操作麻煩，目前，用熒光素標記，即熒光素標記的擴增片段長度多態性，如對尿路菌、大腸埃希菌、空腸彎曲菌和不動桿菌在基因水平作出了鑒定[42]。 末端限制性片段長度多態技術(terminal restriction fragment length poly morphism, TRFLP) TRFLP在技術上與RFLP相似，只是其中的一個引物的5’端用熒光物質標記。這樣所得的PCR產物的一端就帶有這種熒光標記，再將PCR產物用合適的限制性內切酶消化，由于不同菌的核苷酸序列的差異，酶切位點就會存在差異，酶切后就產生了許多不同長度的限制性片段。其中帶有熒光標記的TRFs（末端限制性酶切片段）就可以被DNA自動測序儀檢測到，因為每種菌的末端熒光標記片段長度是唯一的，所以峰值圖上的每一個峰就至少代表了一種菌，從而反映了微生物群落組成情況。通過只測定16S rDNA的TRFs，RFLP分布圖的復雜性減少并且每條可見的帶（片段）代表一個核型或者操作分類單元。TRFLP 有很多優點，首先它不僅能對樣品進行定性分析，還可以進行定量分析。 其次，測試過程自動完成并且結果以圖譜的形式表示出來[ 43, 4449 ] 。再者，PCR 的退火溫度及循環次數在一定范圍內的變化對 TRFLP 圖譜的定量定性分析的影響不大，這在一定程度上確保了實驗的穩定性和可重復性。該方法還因快速、靈敏而被廣泛的應用于菌種的鑒定、各種微生物群落分析、不同樣品間相互關系的檢測、細菌群落結構在時間和空間尺度上的動態變化研究等[4449] 。TRFLP法除提取方法和 PCR 反應的缺陷以外，引物的選擇和酶切是該方法的關鍵，因為不同引物擴增出的片斷不同，獲的TRFLP圖譜也會產生很大的差異。 用不同限制性內切酶得到的群落指紋信息也會不同，一般情況下選擇 2個或 4個酶進行酶切較為合適。 單鏈構象多態性技術(singlestrand conformational polymorphism, SSCP) 該技術是將不同序列的DNA 片段變性后折疊成不同空間構象的單鏈片段，即使是相同長度的單鏈 DNA，因其順序不同或單個堿基差異，所形成的構象也會不同。 不同構象的 DNA 片段進行凝膠電泳時，每條單鏈處于一定的位置，靶 DNA中若發生堿基缺失、插入或單個堿基被置換時，就會出現泳動變位，從而揭示該片段中的基因變異。 該方法靈敏度較高，能檢測出核苷酸的差異，能區別群落中差異較小的種群，也可用于微生物群落演替的分析。同時可以切膠純化直接測序與GenBank上的已知序列比對，得到特異的基因序列，從而達到分類的目的。SSCP 最大的缺點是有些單鏈 DNA 可能形成不同的構象而在不同的電泳位置被檢測到。當某一種群的 DNA 在群落 DNA 中的含量少于 %時，SSCP 法便無法檢測到，若要研究群落中比例極少的群落，需用改進的技術和類群特異的 PCR 引物來完成[50 ]。 變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)和溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis，TGGE) DGGE和TGGE被廣泛應用于土壤微生物的多樣性研究、環境微生物群落結構的監測等方面。DGGE或TGGE就是利用堿基序列上存在差異的不同來區分不同的基因序列。在堿基序列上存在差異的不同DNA雙鏈解鏈時需要不同的變性劑(尿素和甲酰胺的混合物)濃度，DNA 雙鏈一旦解鏈，其在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度將會急劇下降。因此，將PCR擴增得到的等長DNA 片段加入到含有變性劑梯度的凝膠中進行電泳，序列不同的DNA片段就會在各自相應的變性劑濃度下變性，發生空間構型的變化，導致電泳速度急劇下降， 從而使具有不同序列的DNA片段滯留于凝膠的不同位置，使用溴化乙錠、SYBR G