xxxx427中藥質(zhì)量標(biāo)淮的研究講義doc(編輯修改稿)

　

【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 主根中人參皂苷Rbl含量比須很高，人參皂苷Rd在須根中含量較高，即一Rbl與一Rd的比例在主根與須根中恰好倒置。一Rb x是C一20位有兩分子糖，生物合成過(guò)程較長(zhǎng)，則一Rd由 （c一20連分子葡萄糖）變成一Rbl需要較長(zhǎng)的時(shí)間積累，而須根生命周期（挖掘前）比主根短，所以其一Rbl含量比主根低得多，而這種差別也有助于說(shuō)明中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為須根不如主根的作用。指紋圖譜中人參皂苷Rbl及Rd的比例可以清楚地區(qū)別人參主根、須根，從而反映藥品中人參投料的情況。⑤可鑒別未知成分，如五子衍宗丸膠囊的鑒別，說(shuō)明只要薄層色譜可以重現(xiàn)，即使有些成分未知，也可作為鑒別的方法。⑥可同時(shí)鑒別多個(gè)藥材的多種成分，充分發(fā)揮了薄層色譜專屬、快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。如復(fù)方酸棗仁口服液中同時(shí)鑒別人參、淫羊霍、酸棗仁所含多種苷類。取樣品適量，以正丁醇提取，蒸干后用甲醇定容，作為供試液。以人參皂苷RgRe；淫羊霍苷及酸棗仁皂苷A為對(duì)照品，將供試品與對(duì)照品溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿甲醇水（65：35：10）下層為展開劑，展開，取出，晾干，以10%硫酸乙醇液顯色，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同的斑點(diǎn)，人參皂苷RgRe斑點(diǎn)為紫紅色，淫羊藿苷斑點(diǎn)為棕黃色，酸棗仁皂苷為黑紫色，陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)腸透析液中同時(shí)鑒別大黃蒽醌類成分與川芎內(nèi)酯類成分。取樣品適量，以醋酸乙酯提取。蒸干后用甲醇定容作為供試液，以大黃藥材或大黃素、大黃酚與川芎藥材為對(duì)照品，制備對(duì)照品溶液，將供試品與對(duì)照品分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚一醋酸乙酯（1：1）展開，取出，晾干，于365nm紫外燈下檢視，供試品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上川芎呈藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，大黃素、大黃酚顯棕紅色，氨氣黃后變粉紅色。決明子、何首烏與獨(dú)話、羌活等同時(shí)存在，也可以上法鑒別，可得優(yōu)質(zhì)的薄層色譜。復(fù)方五味子沖劑中同時(shí)鑒別甘草中甘草酸與五倍于中沒(méi)食子酸。樣品以乙醚脫脂后，以氨性甲醇提取，制備供試液，以甘草酸銨及沒(méi)食子酸為對(duì)照品，將供試品與對(duì)照品溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯一甲酸一冰醋酸一水（30：2：2：4）展開，以10%硫酸乙醇溶液顯色，于365nm紫外燈下檢視，供試品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。氣相色譜適用于含揮發(fā)性成分的鑒別，如90版藥典收載傷濕止痛膏中鑒別冰片、樟腦；2000及2005版藥典中又增加為鑒別冰片、樟腦、薄荷腦、水楊酸甲酯四種成分，也可結(jié)合含量測(cè)定進(jìn)行，如牛黃清心九中檢麝香酮等。液相色譜也可應(yīng)用，如葛根湯中鑒別麻黃生物堿類，多結(jié)合含量測(cè)定進(jìn)行，很少單獨(dú)用于鑒別試驗(yàn)。（4）其它如光譜鑒別，紫外或紅外光譜等。對(duì)同一品種藥材采用適宜溶劑提取，測(cè)定紫外或紅外光譜有時(shí)可得重現(xiàn)性光譜圖，特別是紅外圖譜吸收峰提供信息多，更有鑒別意義。如樹脂類藥材血竭、乳香，甚至動(dòng)物藥牛黃、礦物藥石膏、膽礬的鑒別等。又如可以紫外光譜鑒別西紅花。但復(fù)方制劑多味藥多組分吸收峰疊加或抵消，難以作歸屬分析，專屬性及重現(xiàn)性等存在問(wèn)題，目前也有作為內(nèi)控指標(biāo)，對(duì)于工藝、投料的監(jiān)測(cè)，假冒、偽劣產(chǎn)品區(qū)別，均可起到一定作用。以上各類鑒別方法均可應(yīng)用，對(duì)成藥中一種藥味的鑒別，一般建立一種鑒別方法，不必過(guò)多重復(fù)，但有時(shí)也需要采用顯微與理化方法結(jié)合鑒定以判斷真?zhèn)巍Ｈ鐧z燕窩摻偽品，采用裂解氣相色譜法，可以燕窩特征峰鑒別，但摻偽物含正品，也可撿出此峰，結(jié)合顯微鑒別則可檢出摻偽物如豬皮屑、瓊脂、銀耳等。又如麝香，只以麝香酮鑒別甚至定量，均難以判定真?zhèn)危锾烊击晗愫晗阃群軐挘?%或更高，%，麝香摻偽50%，如麝香酮的含量仍在合格范圍內(nèi)，結(jié)合顯微鑒別，不但可檢出是否摻偽，且能鑒別摻偽物如魚松、蛋黃等。有些藥材雖具備組織細(xì)胞應(yīng)有的顯微特征，但有的已作了手腳，如提過(guò)人參皂苷的人參，熬過(guò)山楂汁的山楂片，煮過(guò)的鹿茸片渣等，同時(shí)須進(jìn)行理化鑒別甚至含量測(cè)定。3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的有關(guān)問(wèn)題（1）提取純化問(wèn)題色譜技術(shù)雖均具分離與鑒定的雙重功能，且薄層色譜對(duì)樣品的純化程度要求較低，但由于中成藥成分復(fù)雜、干擾較大，難以得到理想的分離效果，且有時(shí)被測(cè)成分含量極少，甚至難以檢出和辨認(rèn)。因此在層析之前，采用化學(xué)方法提取純化至關(guān)重要，不僅除去干擾雜質(zhì)，而且使被檢成分濃度相對(duì)提高，從而可得清晰的色譜圖。提取純化的方法較多。根據(jù)不同制劑的特點(diǎn)及被檢成分的性質(zhì)，將目前常用的前處理方法歸納如下：①選擇適宜的溶劑直接提取（固體劑型）或萃取（液體劑型）。采用單一溶劑提取，如黃連、黃柏以甲醇直接回流提取，鑒別小檗堿；、馬錢子堿；羌活、血竭以甲醇提取，鑒別羌活醇、血蝎素；丹參以氯仿直接提取，鑒別丹參酮IIA，以酸性乙醚提取、鑒別原幾茶醛、原兒茶酸及丹參素；山植以醋酸乙酯提取，鑒別有機(jī)酸；白術(shù)、蒼術(shù)、砂仁、豆蔻等以石油醚、正己烷或乙醚提取，鑒別所含揮發(fā)油等。也有用水為溶劑直接提取芍藥貳或堿水提取甘草酸的。在一個(gè)成藥中結(jié)合有些藥味所含成分的性質(zhì)，采用石同極性的溶劑，依次分離提取，可得較好的分離效果。如龍膽瀉肝九，先以正己烷提取，鑒別當(dāng)歸（內(nèi)酯類成分）；繼以丙酮提取，鑒別關(guān)木通（馬兜鈴酸）；再以甲醇提取經(jīng)氧化鋁小柱，用甲酵沖洗，鑒別龍膽（龍膽苦苷），即能依次鑒別多種成分，又可使各供試液達(dá)到凈化的目的。又如國(guó)公酒，除醇加水溶解，以乙醚提取鑒別佛手；繼以醋酸乙酯提取鑒別橙皮苷，再以正丁醇提取鑒別牛膝中齊墩果酸；最后水溶液再經(jīng)處理鑒別辛弗林，如不經(jīng)以上諸步化學(xué)分離，單靠層折則難以獲得清晰的色譜。②對(duì)蜜九的前處理 由于樣品不易粉碎，有機(jī)溶劑難于直接提取，可先將蜜丸剪成小塊，分步置乳缽中采用套研法，隨加入分散劑如硅藻土、硅膠、石英砂等研磨，使分散成顆粒，過(guò)篩使均勻，也可進(jìn)行定量試驗(yàn)，將樣品與分散劑配比稱量，研勻后精密稱重取樣計(jì)算，如上繼續(xù)采用適宜的溶劑提取。如疏風(fēng)定痛丸，以氨性氯仿提取，鑒別馬錢子中士的寧；烏雞白風(fēng)九以氯仿或二氯甲烷提取，鑒別丹參酮IIA；十全大補(bǔ)丸以乙醇提取，鑒別芍藥苷；歸脾九以正己烷提取，鑒別當(dāng)歸內(nèi)酯等。但須注意，因硅藻土等均具有一定吸附性能，在定量試驗(yàn)中若回收率低，則不能采用。如六味地黃九，中國(guó)藥典90版一部收載方法即采用水溶除蜜，過(guò)濾，使藥渣干燥后再用有機(jī)溶劑提取山茱萸中熊果酸的方法，曾采用加硅藻土制成細(xì)粒后提取對(duì)比。回收率低于90%。但以水除蜜，只測(cè)定脂溶性成分才可采用。95版藥典中采用以水除蜜的方法測(cè)定山茱萸中熊果酸，2000版藥典采用以水除蜜及加硅燥土的方法測(cè)定，2005版為減少硅藻土的吸附用50%甲醇提取，過(guò)柱的方法測(cè)定山茱萸中熊果酸的含量，使擦誒多能工結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。③大復(fù)方中揮發(fā)性成分的分離微量升華法：取適量樣品，進(jìn)行微量升華，，將供試樣品置圈內(nèi)，上蓋一載破片，以酒精燈緩緩加熱，取載玻片滴加適量丙酮溶解，作為供試品溶液。如檢麻黃堿，樣品以10%氫氧化鈉溶液濕潤(rùn)后再加熱升華。親脂性溶劑提取法；取樣量小，簡(jiǎn)便易行，但凈化程度不及升華法和蒸餾法，適用于處方藥味少的制劑。揮發(fā)油測(cè)定器蒸餾法：不僅可用于多種成分的定性，并適用于定量方法的前處理。即將蜜丸（約兩丸）剪碎，加水20m1研細(xì)，移入圓底燒瓶中，再加水適量與玻璃珠數(shù)粒，混勻，連接揮發(fā)油測(cè)定器，自測(cè)定器上端加水至刻度，并溢流入燒瓶時(shí)為止，再加入正己烷（苯或石油醚（60～90℃）～2m1，連接回流冷凝器，加熱至沸，并保持微沸2h，放冷，分取正己烷層，以無(wú)水硫酸鈉脫水作為供試品镕液。90版藥典通宣理肺丸中鑒別紫蘇即用此法。如用于定量，則須精密加入正己烷，以加入毫升數(shù)計(jì)算結(jié)果。也可取正己烷部分定容于容量瓶中，用溶劑洗滌測(cè)定器，減少微量正己烷與水混合后體積損失造成的誤差。曾用此法測(cè)定牛黃清心丸中麝香酮與冰片獲得成功。④檢定苷元類成分 在鑒別試驗(yàn)中，將樣品先置于乳缽中加酸研磨，后取上溶液再加熱回流，用適宜溶劑萃取制備供試液。如90版藥典收載龜齡集、定坤丹檢人參二醇、人參三醇即是（2000年版中該方法已改為測(cè)定人參皂苷RgRe、Rb1），或?qū)悠方?jīng)適宜溶劑提取后加酸回流水解。再以溶劑萃取，如大黃檢蒽醌類成分；知母檢菝葜皂苷元，如用于定量，只能用后者。⑤含生物堿類（季銨堿除外）、酚類及有機(jī)酸類成分 主要是利用生物堿、酚、有機(jī)酸類等特有的性質(zhì)，對(duì)樣品進(jìn)行純化，方法有兩種：先用極性溶劑提取，回收溶劑，殘?jiān)运芙猓{(diào)節(jié)不同pH后，再經(jīng)有機(jī)溶劑萃取純化，即采用液液萃取法。如含生物堿樣品用甲醇或乙醇提取，蒸干，用2%鹽酸溶解殘?jiān)瑝A化至pH9，再用氯仿萃取后制備供試液。另一種為堿化或酸化使成分游離，用有機(jī)溶劑提取，再用酸堿進(jìn)一步處理凈化。如測(cè)馬錢子中士的寧，先用氨性氯仿浸提，以酸水萃取士的寧，再經(jīng)堿化，以有機(jī)溶劑萃取士的寧，制備供試液；對(duì)酚、酸類則與生物堿性質(zhì)相反，利用其在堿水中成鹽，而酸化后溶于有機(jī)溶劑的性質(zhì)，純化除去雜質(zhì)，如分離丁香酚，丹皮酚、檸檬酸、琥珀酸、大黃酸、膽酸等，只是對(duì)酚類須用強(qiáng)堿而酸類用碳酸氫鈉即可。⑥對(duì)某些成藥中雜質(zhì)如油脂、蛋白、氨基酸或色素等，或有些雜質(zhì)性質(zhì)不清楚，但往往造成薄層背景深（特別是以硫酸顯色），有時(shí)雖可辨認(rèn)斑點(diǎn)作鑒別試驗(yàn)，但定量無(wú)法進(jìn)行。可以碳酸鎂、硅藻土等將固體制劑或提取物共研拌勻，或?qū)⒁后w制劑吸附，拌勻，采用固液萃取。也有將提取液通過(guò)小柱，如氧化鋁、活性碳（或二者按一定比例混合應(yīng)用）、硅膠、聚酰胺、大孔吸附樹脂柱等，目前常用的還有化學(xué)鍵合相小柱加硅烷化硅膠小住（C8，C18小柱），氨基鍵合相預(yù)處理柱、腈基鍵合相小柱等。如藥典收載黃連測(cè)總生物堿均通過(guò)中性氧化鋁柱；復(fù)方桅子沖劑測(cè)桅子苷通過(guò)中性氧化鋁與活性碳（2：）混合小柱；復(fù)方金錢草沖劑鑒別金錢草中黃酮成分、黃芩中黃芩苷及陳皮中橙皮苷過(guò)聚酰胺小柱；國(guó)公酒中鑒別辛弗林通過(guò)732型氫型陽(yáng)離子交換樹脂柱等。但用氧化鋁須注意粒度以100一150目為宜，過(guò)細(xì)極難濾過(guò)；活性碳可用柱層折用規(guī)格，被檢成分也因吸附而損失。用石油醚、乙醚、己烷等除去制劑賦型劑中的油脂，如牛蒡子等種子類藥材所含脂肪油的處理；用甲醇或乙醇沉除液體制劑中的蛋白，如以高效液相法測(cè)王漿制品中葵烯酸的前處理即加甲醇離心；人參、西洋參、黃芪等自身含較多的氨基酸成分，在正丁醇提取后，以氨水或堿水萃取，可達(dá)凈化的目的。其它影響背景深的因素 有些因索并非來(lái)自雜質(zhì)，而是層析條件引起。為增加薄層板的硬度便于定量點(diǎn)樣，經(jīng)加溫后，變灰至灰黑色，%以下，控制加熱溫度和時(shí)間，從而可以得與硅膠G板相同的效果。對(duì)某些顯色劑如稀碘化鉍鉀鑒別生物堿、茚三酮鑒別氨基酸或肽，或用指示劑鑒別有機(jī)酸等成分，展開溶劑必須完全揮干后才可噴用，否則背景深，反差小，無(wú)法測(cè)定含量。⑦對(duì)于含乙醇的酊劑、酒劑甚至口服液均應(yīng)將乙醇揮去，或徹底蒸干，以適宜的溶劑萃取或提取。如復(fù)方人參酊去醇后，以氯仿提取檢丹參中丹參酮IIA；陽(yáng)威藥酒去醇后，以甲醇定容，即可進(jìn)行補(bǔ)骨脂素的薄層鑒別試驗(yàn)。以上方法有時(shí)尚須綜合應(yīng)用，單靠一種手段往往不能達(dá)到凈化的目的。但也有由于制刑工藝純化步驟較多，也可直接作為供試液做色譜分析的。如云香精、正骨水中測(cè)冰片，藿香正氣水中測(cè)厚樸酚，某些注射劑測(cè)揮發(fā)性成分等，均可以氣相色譜法直接進(jìn)樣測(cè)定。（2）層析條件的選擇：層析技術(shù)在一些專著與文獻(xiàn)中均有詳細(xì)論述，僅結(jié)合新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中主要對(duì)薄層鑒別中要求與注意問(wèn)題討論如下：①新藥經(jīng)批準(zhǔn)生產(chǎn)，質(zhì)量標(biāo)難試行兩年后即轉(zhuǎn)為部頒標(biāo)準(zhǔn)，因此在檢驗(yàn)方法的選擇上，首先即應(yīng)考慮規(guī)范化問(wèn)題，與發(fā)表學(xué)術(shù)論文的要求不同。如新藥欲檢成分的鑒別藥典已有收載，則應(yīng)先采用與其相同層析條件，如不能適用，再研究選用另外方法，一般要求展開劑至少選兩種極性相差較大的溶劑系統(tǒng)，擇優(yōu)收入員量標(biāo)準(zhǔn)正文中。②對(duì)顯色劑的選擇應(yīng)