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免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課件(編輯修改稿)

2025-09-01 02:34 本頁面

　

【文章內(nèi)容簡介】 1％瓊脂用 pH 鹽酸緩沖液配制，冰箱保存?zhèn)溆?。 5．電泳儀、電泳槽、載玻片、打孔器、 10 ml吸管、移液器、移液頭。【實(shí)驗(yàn)方法】 1．制板 2．打孔 3．加樣將抗原加入瓊脂板上有標(biāo)記孔側(cè)的小孔中，抗體加入另一側(cè)小孔中，以加滿為度，不可溢出孔外。 (如圖示 ) 4．電泳將加好樣品的瓊脂板置電泳槽上，抗原側(cè)置陰極端，抗體孔側(cè)置陽極端。搭好橋后，接通電源，控制電壓 6～ 10 V/cm板長，電泳約 30～ 60 min。 5．關(guān)閉電源，取出瓊脂板，觀察結(jié)果。 Ag Ab Ag Ab 標(biāo)記孔沉淀線【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】將玻片對著強(qiáng)光源，先觀察 AFP陽性血清孔與抗體孔之間的白色沉淀線，然后再觀察待檢血清孔與抗體孔之間是否也有沉淀線出現(xiàn) ，如有沉淀線，則表示AFP試驗(yàn)陽性，否則 AFP試驗(yàn)為陰性。【注意事項(xiàng) 】 1．電泳時電流不宜過大，以免蛋白變性。 2．抗原和抗體的電極方向不能搞錯。 3．抗原和抗體的濃度要適當(dāng) ，抗原太濃或太稀都不易出現(xiàn)沉淀線。 4．電泳所需時間與孔間距離有關(guān) ，距離越大，電泳時間越長。【實(shí)驗(yàn)思考】 1．單向擴(kuò)散與火箭電泳、雙向擴(kuò)散與對流免疫電流比較各有何特點(diǎn) ？ 2．對流免疫電泳中，抗原為何放陰極端，抗體為何放陽極端？外周血單個核細(xì)胞的分離【實(shí)驗(yàn)?zāi)康?】 1．熟悉免疫細(xì)胞分離的常用方法。 2．掌握外周血單個核細(xì)胞分離方法的原理、操作規(guī)程。【實(shí)驗(yàn)原理】人外周血單個核細(xì)胞（ peripheral blood mononuclear cell， PBMC）包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。單個核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其他細(xì)胞不同。因此利用一種介于～滲的聚蔗糖泛影葡胺（ ficollhypaque）混合分離液作密度梯度離心，離心后不同比重的血細(xì)胞在分離液中呈梯度分布。從而分離出 PBMC。【實(shí)驗(yàn)材料】 1．肝素溶液用生理鹽水將肝素配成 125～ 250 U/ml的溶液，置 4 ℃ 下保存?zhèn)溆?。 2．淋巴細(xì)胞分層液市售或自配， 20 ℃ 時密度應(yīng)為 (177。 ) g/L。 3． Hanks平衡鹽溶液（ HBSS）或磷酸鹽緩沖液（ PBS） pH ～。 4．完全 RPMI1640培養(yǎng)液。 5． 15 ml或 50 ml錐底離心管。 6．水平離心機(jī) ，顯微鏡。 7．玻璃吸管，滴管，細(xì)胞計數(shù)板等。 8． 2％臺盼藍(lán)染液。【實(shí)驗(yàn)方法】 1．采集靜脈血若干毫升（隨需要而定），注入盛有肝素的無菌小瓶中（每 ml全血加 ml 肝素溶液），加蓋后立即輕輕搖勻，使血液抗凝。 2．用吸管加入等體積的室溫 HBSS或 PBS，使血液等倍稀釋。（此步驟亦可省去） 3．吸取淋巴細(xì)胞分層液（每 10 ml稀釋血加5 m1分層液）置于 15 m1或 50 m1離心管中，然后將離心管傾斜 45176。角，將稀釋血液在距分層液界面上 1 cm處沿試管壁緩慢加至分層液上面。應(yīng)注意保持兩界面清晰，勿使血液混入分層液內(nèi) 。 4．將離心管置水平式離心機(jī)內(nèi)，在 18～20 ℃ 下，以 2022 r/min離心 30 min，離心后，管內(nèi)分層如下圖所示 5．用毛細(xì)吸管輕輕插入灰白色層，沿管壁輕輕吸出該層的單個核細(xì)胞，盛入另一支離心管中。 6．將所得到的 PBMC懸液用 5倍體積的 HBSS或 RPMIl640洗滌 2次，依次以 2 000 r/min，1500 r/min在室溫（ 18～ 25℃ ）下離心 10 min，棄上清。 7．用完全 RPMI1640定容細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞后再調(diào)整細(xì)胞至所需濃度。 8．用臺盼藍(lán)染液檢查所分離細(xì)胞的活性：取 2滴細(xì)胞懸液加 1滴 2％臺盼藍(lán)染液， 5～ 10 min后取樣作濕片高倍鏡檢。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】

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