基因克隆及克隆基因的表達(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 生物中復制的載體。 這類載體不僅具有細菌質粒的復制原點及選擇標記基因；還有真核生物的自主復制序列及選擇標記性狀；具有多克隆位點。 通常穿梭載體：在細菌中用于克隆（擴增克隆的基因）， 在酵母菌中用于基因表達分析。 LOGO 表達 載體用于外源 DNA的 表達 表達載體（ expression vector）：用來在宿主細胞中 表達外源基因 的載體 依據其宿主細胞的不同可分為 : 原核 表達載體（ prokaryotic expression vector） 真核 表達載體（ eukaryotic expression vector） LOGO 三、目的 DNA與載體連接（接） T4DNA ligase LOGO Ligation EcoRI EcoRI RE digestion Vector EcoRI Vector RE digestion Rebinant vector Rebinant vector Rebinant vector EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI ① 單酶消化的粘性末端連接 ： 連接效率高 。 載體需去磷酸 。 雙向連入載體 LOGO Vector SmaI HeaIII SmaI RE digestion RE digestion Vector Ligation Helf of smaI Rebinant vector SmaI Helf of HeaIII Rebinant vector SamI Helf of smaI Helf of HeaIII ② 平頭末端連接 ： 連接效率低 雙向連入載體 自身環化率高 LOGO Target gene EcoRI BamHI EcoRI BamHI Vector Vector digestion digestion Ligation Vector EcoRI BamHI ③ 雙酶消化的粘性末端連接： 連接效率高 。 定向連接 . LOGO Vector EcoRV EcoRV digestion Vector Taq DNA polymerase dTTP TVector 539。 539。 T T 539。 539。 A A PCR product Rebinant vector A A T T PCR product Ligation ④ TA粘性末端連接 ： 連接效率高 雙向 連入載體 自身環化率 LOGO 四、重組 DNA轉入宿主細胞進行擴增（轉） 宿主細胞 感受態細胞（ petent cell）： 處于易于接納外源物質的狀態的細菌 LOGO 轉化 （ transformation） 質粒或黏粒 → 細菌 質粒 → 酵母 （真核細胞） 轉染 （ transfection） 外源 DNA→ 真核細胞（酵母除外） 感染 （ infection） 噬菌體顆粒 → 細菌 病毒顆粒 → 哺乳細胞 幾個相關概念： LOGO 將重組 DNA轉入受體細胞的常用方法： 化學法： 氯化鈣法 物理法： 電擊法 顯微注射法 等 LOGO 氯化鈣化學轉化法 LOGO 電擊法 利用瞬間高壓在細胞上打孔 LOGO 顯微注射法 LOGO Rebinant vector Rebinant vector 連接產物 感受態細胞： Ligation mixture LOGO 篩選出含有 重組 DNA(目的基因 +載體 )的克隆 轉化后的克隆群體： LOGO 五、重組體的篩選與鑒定（篩） 1. 抗生素抗性篩選 2. 藍白篩選 3. 限制性內切酶法 4. PCR法 5. DNA測序法 主要方法： LOGO 五、重組體的篩選與鑒定（篩） 細胞在含有相應抗生素的培養基中培養： 無載體轉入的細胞 ——dead；含有載體的細胞 ——alive。 1. 利用 抗生素抗性標志 可篩選出帶有載體的重組子 尚需進一步鑒定載體是否為含有目的 DNA的重組載體 LOGO IPTG Bluewhite screening of rebinants 誘導物 β半乳糖苷酶 Lac Operon ? ——在指示培養基上用顏色直接篩選重組克隆的方法 五、重組體的篩選與鑒定（篩） 2. 藍白篩選 LOGO Blue colony IPTG Xgal 藍色 吲哚產物 β半乳糖苷酶 Xgal ? ? ? Blue cell. LOGO 如果外源基因插入位于LacZ基因內部的多克隆酶切位點 ， 則不能通過α互補編碼 β半乳糖苷酶 ，菌落呈 白色 。 α互補 菌株 帶有 β半乳糖苷酶 C端 的編碼序列 載體質粒 帶有 β 半乳糖苷酶 N端 的編碼序列 藍白篩選的基本原理： β半乳糖苷酶 可分解培養物中的 Xgal，使其呈 藍色 。 LOGO 3. 限制性內切酶法 ： 根據限制酶切圖譜篩選特定 DNA 五、重組體的篩選與鑒定（篩） Linear vector (2700bp) insert (300bp) M 空質粒 重組質粒 NcoI HindIII 2700bp 300bp 提取陽性克隆的重組 DNA RE消化 電泳 有無 DNA片段的插入； 插入片段的大小 連接前用什么酶， 就用什么酶切 LOGO 可明確序列和閱讀框的正確性 5. 核苷酸序列測定 是最準確的鑒定目的 DNA的方法 五、重組體的篩選與鑒定（篩） ?利用序列特異性引物，可鑒定陽性克隆。 ?如利用克隆位點兩側序列設計引物進行 PCR，再結合序列分析，能可靠地證實插入片段的方向、序列和閱讀框的正確性。 4. PCR法 ：直接鑒定目的 DNA的存在 LOGO 基因工程（ geic engineering） 重組 DNA技術（ rebinant DNA technology） 分子克隆（ molecular cloning） DNA克隆（ DNA cloning） 基因克隆（ gene cloning) 基因操作（ Gene manipulation ） Short Summary of gene cloning： LOGO Short Summary of gene cloning： 是指進行制備 DNA片段，并通過載體將其導入受體細胞，在受體細胞中復制、擴增，以獲得 單一 DNA分子 大量 拷貝的過程。 What？ How？ M LOGO Why？ “獲得單一 DNA分子的大量拷貝 ” The way to get a DNA clone Gene Therapy Gene analysis Gene modification Medicine Vaccine Transgene gene knockout Expression Short Summary of gene cloning： LOGO 1973年， Cohen和 Boyer第一次完整地建立起了基因克隆體系 Stanley Cohen (Stanford) Herbert Boyer (UCSF) ?DNA重組技術創立近 40年來所獲得的豐碩成果已經把人們帶進了一個不可思議的科學世界 Transformation Plasmid 1 Plasmid 2 RE RE ligase Rebinant plasmid LOGO 基因克隆技術 重組蛋白 ?人源抗體 ?重組多肽藥物 ?重組疫苗 DNA序列測定 重組載體 ?基因治療載體 ?RNA轉錄載體 ?打靶載體 ?轉基因載體 基因敲除動物模型 轉基因動物模型 發夾 RNA RNAi 核酸探針標記 分子雜交 ?Southern blot ?Northern blot 構建文庫 ?基因組文庫 ?cDNA文庫 基因合成 PCR克隆 亞克隆 基因突變 基因克隆技術是分子生物學的核心技術 LOGO 克 隆 基 因 的 表 達 —獲取重組蛋白 重組子 目的基因的mRNA 表達蛋白質 LOGO 亞克隆（ Sub cloning） 克隆載體 表達載體 LOGO 原核表達系統 Prokaryotic expression system Eukaryotic expression system 真核表達系統 大腸桿菌 酵母 昆蟲細胞 哺乳動物細胞 轉化宿主細胞 Rebinant vector promoter Target gene Prot